课件：血型课件分析.ppt

Rh（D）血型鉴定及 临床输血策略,RH血型的研究历史,19世纪40年代发现了人类红细胞RH血型 19世纪60年代,发现了RH血型不合的有效治疗方法 19世纪80年代,成功分离了RH蛋白 19世纪90年代,认识了RH基因结构 20世纪90年代,清楚了RHD和RHCE的氨基酸序列,RH血型系统的发现,1940年,发现多数人红细胞上有一种血型抗原物质,与恒河猴（Rhesus monkey)红细胞的抗原物质是相同的. 1940年还发现,三例ABO血型相同，同种输血后却发生了严重的输血反应. 同一年，一名O型孕妇产后大出血，输入O型丈夫的血液后发生了溶血性输血反应，这是人类由于妊娠产生的同种免疫作用的第一例报告 这就表明除ABO血型系统外,还存在另外的血型系统.,RH血型系统的命名,“Rh”是根据恒河猴英语单词的前两位字母而由来 我们现在通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性 RH系统还有C、c 、E 、e 四种抗原，也有用1、2、3、4、5来表示，D+红细胞有用RH1表示，而D-细胞用RH-1来表示，相应的等位基因用R1和R-1来表示,RH血型的意义,临床意义很大! RH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有，比率为0.3%左右，在欧美等白种人中，比例较高为15%左右。 RH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应，胎、母RH血型不合的妊娠有可能发生新生儿溶血病，严重者可导致新生儿死亡,或是使胎儿死于子宫内。 RH血型的检查和ABO血型同等重要，已被列为血型的常规检查之一。,RH血型是如何遗传的?,RH(-)基因是隐性基因。 当RH阳性的父母都带有RH阴性基因，且同时遗传给后代时，其后代即表现为RH阴性。 当双亲中有一人是RH(-)时，其子女为RH(-)的机会增大。,RHD(-)有何意义?,正常RHD阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RHD阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RHD阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就可能发生严重的输血反应甚至造成死亡。 RHD阴性的妇女怀有RH阳性的胎儿，胎儿的红细胞就会刺激母体产生抗-D抗体，当再次怀有RHD阳性的胎儿时，可以导致新生儿溶血性贫血而死亡。,RHD(-)者如何自我保护?,RHD阴性者一般情况下尽量避免输入RHD阳性的血液，必须输注相同的RH阴性血，以免由于RHD血型不合而发生输血反应。80%的RHD阴性病人在输入200ml阳性红细胞后，在2-5个月后，血浆中可检测到抗体。 RHD阴性的妇女应注意婚后避免流产，保证第一胎正常分娩，以防发生RH新生儿溶血病。有资料统计14.3%的多次妊娠的D阴性孕妇产生抗-D抗体，导致新生儿溶血病。,血站为RHD(-)者做哪些工作?,常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者。 对有流产史的RH阴性的妇女，在妊娠初期做一些关于RH血型系统的产前免疫检查。 一旦发生RH新生儿溶血病，立即用RH阴性的同型血液进行换血治疗，挽救新生儿的生命。,关于RhD表型 1.RhD阳性 中国汉族：约99.7% 白人：约85% 2.RhD阴性 中国汉族：约0.03% 白人：约15% 3.弱D（Weak D) 4.部分D（Partial D) 5.Del型 现今的称谓：D Variant（D变异型）,弱D型(Weak D),血清学表现为盐水介质阴性,IAT检测为阳性. D抗原数量的减少,但抗原表位数目基本不变.抗原的质量不变 碱基突变形成，改变的氨基酸位于细胞膜层的中间或细胞膜层内,部分D(Partial D),红细胞缺少某些（部份）的抗原表位 与正常抗原相比，抗原的质量发生了变化.(正常红细胞上抗原包含个表位） 形成原因：基因单或多核苷酸碱基取代、杂交基因。 所改变的氨基酸位于抗原分子的细胞膜外部分.,部分的危险性,许多部分的红细胞与抗直接反应，但有些需要用才能鉴定，细胞的反应强度不一样，取决于试剂的制造商 部分的个体是可以产生抗，因此必须接收的血液，在日常工作中许多部分都被定为，往往在产生抗体以后才被发现,DEL型(D 放散型),盐水介质阴性,IAT检测阴性,但吸收放散试验阳性. 红细胞上D抗原数目比弱还要少,红细胞上D抗原的质量也有变化的 某些型红细胞抗原缺失某些表位，可以产生抗抗体. 第九外显子碱基突变形成.,典型的抗原密度比较,各种实验对应的试剂 血型血清学 分子生物学 单克隆抗-D PCR试剂盒（商品化） IgM IgG 自行设计引物（难度大） IgM + IgG 多克隆抗-D 如何用？何时用？能解决什么？,D抗原的检测方法,RHD血型鉴定流程,盐水介质检测,阳性,阴性,抗人球蛋白介质,阳性,阴性,阳性,加做直抗实验,吸收放散实验,阴性,放散实验,再次定型,阳性,阴性,Del,PCR-SSP,受检标本,Weak D/Partial D,测序,RHD基因进化,RHAG RHce RHce和RHce复制体 RHCE基因和RHD基因,RHD基因的进化,RHD基因的祖先基因是Rh 相关糖蛋白基因(RHAG 基因),该蛋白有一条N多糖链.RHAG和RHD、RHCE有38%的同源性，在红细胞上具有相同的拓扑结构，由位于6号染色体上的单个基因编码。RHAG不具有多态性，所以它不携带血型抗原，但是它对RHD和RHCE定向到膜上有重要作用。没有RHAG，RHCE和RHD都不能表达到红细胞膜上.在红系的分化中先表达RHAG,然后表达RHCE,再表达RHD. RHAG基因首先复制形成Rhce基因, 第二次复制发生在同一染色体短臂,形成“Rhce 复制体”,随后Rhce基因 和其复制体沿不同的途径进化,最终形成现今人类的RHD基因,而RHce 基因经过突变或与RHD基因发生交换形成常见的Rhce RHcE RHCe RHCE基因.,RhD基因结构,RH基因结构目前已确定:位于染色体1p34.3-36.1,主要由RHD和RHCE两个基因组成.这两个基因的 3, 端相对,相隔约有 3万bp.在它们之间为小膜蛋白1基因(SMP1),即SMP1基因. 在RHD基因两侧各有一段约9000bp 的侧翼序列片段,称为RH盒子(Rhesus box )序列,5端为上游R盒子(Upstream),长9142bp ,3端为下游R盒子(Downstream Rhesus box),长为9145bp ,上下游盒子方向相同,与RHD基因一致. RHD和RHCE基因各由10个外显子组成,二者有43个碱基有差异,其中第1、2 、8外显子序列基本一致，所以绝大多数RHD基因测定中，引物选择扩增RHD基因的3-7以及9-10外显子。 通常只有D抗原阳性个体拥有一或二条RHD基因，而D阴性个体则缺失RHD基因，RHD阴性个体的RHD基因缺失发生在上下游盒子之间，并形式一个融合（Hybrid Rhesus box)。,RHD基因locus,RH 和基因结构图,1p36.11,RHD等位基因的形成,基因缺失：RHD基因完全缺失形成RHD(-)单倍体； 基因交换：由于RHD基因和RHCE基因在RH座位上方向相反，二个同源基因之间发生交换的机率增大，通常RHCE基因为供者基因，RHD为受者基因； 碱基变异：包括突变、缺失、mRNA拼接位点变异等。,2019/4/22,24,可编辑,近几年的研究发现,D基因结构存在种族差异,RhD(-)白种人中,D基因是完全缺失的. 在黑人中,RHD（-）个体，D基因却完整存在，66%的D基因在第3内含子和第4外显子之间有37bp的插入片断，导致了抗原的不表达。 黄种人中RhD(-)个体表现出明显的多态性.,黄种人D基因的多态性,D基因完全缺失(10个外显子全部缺失)导致了D抗原的不表达. D基因的部分缺失,(有两边缺失和中间缺失)导致D抗原的不表达. D基因完整存在,(碱基突变),导致D抗原不表达.,RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因 基因交换形成的融合等位基因,RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因 碱基变异形成的等位基因,Del等位基因,All DEL alleles are associated with Ce,RhDel型基因变异,K409K又叫1227A,指第九外显子最后一个基因GA突变，也是第九外显子与第九内含子拼接位点的碱基突变，虽然位置氨基酸末改变，但是剪接点突变导致产生了不正常的抗原,弱D等位基因（种）,部分D等位基因,中国人RhD分子背景,中国人RhD分子背景,D阳性个体的RHD基因与在其它民族中报道的正常RHD基因序列相同； 真实D阴性中国人中以RHD-CE(2-9)-D2等位基因为主，比率为10.5%； 同时还存在比率不低的个体因碱基变异导致RHD基因ORF错位，导致正常D抗原不能表达。 在真实D阴性中国人中RHD基因总阳性率为15.8%,中国人RhD分子背景,中国人Del个体主要携带RHD 1227A等位基因(K409K)。该等位基因是Genbank收录的第一个Del等位基因 (GenBank记录AF390110)，但也是中国人中唯一发现的Del等位基因，而在欧洲人中除RHD1227A等位基因外，还观察到另外几种Del等位基因 弱D表型个体目前发现主要是弱D15型、还发现了2例RHD 1227A等位基因携带者； 部分D表型观察到DVa(Hus)和DVI III型。,中国人RHD等位基因,RHD基因分型技术的应用,血清学定型结果难以判定,为了防止某些弱D被误定为RH-,用分子生物学检测作为辅助手段； D抗原弱阳性个体的弱D型或部分D型别的鉴定； 通过羊水预测胎儿的D表型； 慢性多次输血患者、大量输血患者、同种免疫或自身免疫溶血性贫血患者、以及红细胞直接抗球蛋白实验阳性患者的D抗原表型的检测和纠正； 对于中国人，鉴定Del表型,中国人RHD的未来研究方向,真实D阴性个体RHD基因序列研究，进一步了解产生中国人D抗原阴性的特性分子机制，发现更多的RHD等位基因 ： D抗原弱表现型个体的分子背景研究，用以了解中国人弱D和部分D表型的常见型及频率。目前在中国人中观察到的弱D型是弱型和二种部分D型，而国际上报道的弱D型确有很多种，而不同分子机制形成的其它部分D表型也很多,中国人RHD的未来研究方向,有关Del研究，Del在中国人中比率非常高，综合近几年的文献，在经IAT确认的D阴性群体中平均为28.1%。尽管目前国家没有要求DEL型血液不能供应给临床,但是从理论上来讲,DEL型是有可能刺激机体产生抗体的。 稀有血型的分子生物学研究和调查。,1.RhD阳性/阴性，同型输注 2.D变异型的输血 2.1弱D的围产期妇女被误定为D-，而给予了不必要的RHD免疫球蛋 白，同样是无害的 2.2弱D血液被误定为D-,而输注给了D-患者，要注意，尽管弱D抗原免 疫原性较弱，但也可能使D-者致敏 2.3弱D1.2.3型产生抗-D可能性较小，弱D11和15型已有产生抗-D的报 道，其他弱D产生抗体的风险不清楚。,RHD血型输血策略,2.4部分D患者输入D+血液后，可能会产生针对其缺失抗原部分的抗-D,3.急救情况下的输血 3.1正常成年男性或不需再生育女性 3.2未生育女性：要高度重视， 见临床输血技术规范 第十条 对于Rh（D）阴性和其他稀有血型患者，应采用自身输血、同型输血或配合型输血。 第十五条 输血科（血库）要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型（正、反定型），并常规检查患者Rh（D）血型（急诊抢救患者紧急输血时Rh(D)检查可除外），正确无误时可进行交叉配血。,RHD血型输血策略,不同型输注产生抗-D的