课件：分子生物学基因突变.ppt

基 因 突 变 & 相 关 技 术,Dr. Liu Ji ,Natural Selection,February 12th ,2009 marked the 200th birthday for famous evolution scientist Charles Darwin (02/12/1809-04/19 /1882), who laid the foundations for the evolution theory - mutation & natural selection. As per Darwin, mutation provides new traits for species, and then the nature “selects“ those species with advantageous heritable traits - the process Darwin called “natural selection“.,Natural Selection,Science and Research,如果要对近几年的社会话题按照“敏感指数”排出一个名次的话，转基因食品的安全问题恐怕至少要入围三甲。究其背后的原因，如果不是转基因食品在安全性问题上确有遮掩、隐瞒的话，那么我们就该反思，是不是真正地了解了“转基因食品的安全性到底是怎么一回事儿？”,转基因食品的安全问题,Evolution,Mutations are engines of natural selection,Spiral goat,George was all mouth,The eyes have it,Back to the Water,Science: 科学家揭示 人类长相各异的原因,人类的长相各异，没有两个人长相完全相同的。是什么导致了人面部形态各异呢？遗传学证据显示父母和子女长相类似，但是哪些因素使得DNA调控如此精确，使得两个人长相不同呢？ 伯克利国家重点实验室的科学家揭示了增强子在面部发育中发挥重要作用。相关报道发表在近期的Science杂志上。该文章的通讯作者Axel Visel博士称其研究结果表明很可能人类基因组中的数千个增强子都不同程度的参与到面部发育过程中。,该研究总共分析了四千多个可能与面部发育相关的增强子序列，建立了增强子序列的基因组图谱。此外他们还细致分析了其中200个基因增强子的活性。子女遗传了父母的基因，但是由于增强子的存在，在面部发育过程中基因活性不尽相同，最终导致面部发育结果不完全相同。该结果还提示遗传学家，增强子的特异突变也会在新生儿缺陷中发挥作用。有助于开发更好的诊断和治疗措施。,Fine Tuning of Craniofacial Morphology by Distant-Acting Enhancers Catia Attanasio, Alex S. Nord, Yiwen Zhu, Matthew J. Blow, Zirong Li, Denise K. Liberton, Harris Morrison, Ingrid Plajzer-Frick, Amy Holt, Roya Hosseini, Sengthavy Phouanenavong, Jennifer A. Akiyama, Malak Shoukry, Veena Afzal, Edward M. Rubin, David R. FitzPatrick, Bing Ren, Benedikt Hallgrmsson, Len A. Pennacchio, Axel Visel The shape of the human face and skull is largely genetically determined. However, the genomic basis of craniofacial morphology is incompletely understood and hypothesized to involve protein-coding genes, as well as gene regulatory sequences. We used a combination of epigenomic profiling, in vivo characterization of candidate enhancer sequences in transgenic mice, and targeted deletion experiments to examine the role of distant-acting enhancers in craniofacial development. We identified complex regulatory landscapes consisting of enhancers that drive spatially complex developmental expression patterns. Analysis of mouse lines in which individual craniofacial enhancers had been deleted revealed significant alterations of craniofacial shape, demonstrating the functional importance of enhancers in defining face and skull morphology. These results demonstrate that enhancers are involved in craniofacial development and suggest that enhancer sequence variation contributes to the diversity of human facial morphology.,doi: 10.1126/science.1241006,运动和咖啡因 会改变你的DNA,你可能会认为不管做任何事情，自己的DNA都是不会受影响而改变的。但在某种意义上说，这一想法是错误的。在3月Cell出版社的细胞代谢杂志上，研究人员发表报告称当身体处于健康状态时，不怎么运动的男性和女性在运动锻炼几分钟后，他们体内的DNA会出现瞬间变化。更让人惊奇的是，这项研究表明我们早晨喝的咖啡中咖啡因成分也可能会以相同方式影响肌肉中的DNA。,doi:10.1016/j.cmet.2012.01.001,女性携带离婚基因 A-allele 者离婚率高出五成,很多时候，当婚姻出现问题时，人们会把责任怪罪在男方头上，认为男士的花心导致了婚姻破裂。 在近期的Biological Psychiatry杂志上刊登的一项研究成果表明，据瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院的最新研究发现，婚姻出现破裂也有可能是女性体内携带的一种基因作祟所致。一种叫A-allele的催产素受体基因会在女性体内搞怪，让女性对婚姻关系中偶尔出现的不和谐插曲缺乏耐心，脾气暴躁，从而提高离婚率。 女性处于生产期和哺乳期时体内会自行分泌催产素，这种激素能拉近女性和后代间的关系。不过若催产素分泌异常就会搅乱大脑对感情问题的处理能力，催生叫A-allele的“离婚基因”。研究人员调查了1800名女性后发现携带这种基因的女性离婚率高50%。,doi:10.1016/j.biopsych.2011.09.002,概念及分类 诱因与特点 突变与疾病 突变与遗传工程技术 突变的检测,基因突变概要,A mutation has caused this garden moss rose(百叶蔷薇) to produce flowers of different colors. This is a somatic mutation that may also be passed on in the germ line,概 念： 基因突变：基因组DNA分子中发生碱基的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变，进而引起遗传表型的改变。,一、概 念 及 分 类,Illustrations of five types of chromosomal mutations.,Cells with one additional set of chromosomes, for a total of 69 chromosomes, are called triploid,When an individual has two or more cell populations with a different chromosomal makeup, this situation is called chromosomal mosaicism.,In a balanced translocation, pieces of chromosomes are rearranged but no genetic material is gained or lost in the cell.,Mitochondria provide the cells energy.,基因突变指一个基因变为它的等位基因，是基因分子结构或化学组成上的改变。,染色体的结构及数目改变,突 变 分 类（遗传信息的改变）,突变 分类,碱基改变,密码效应,点突变（point mutation） 碱基插入突变（base insert ） 碱基缺失突变（base deletion）,同义突变（synonymous mutation） 错义突变（missense mutation） 无义突变（nonsense mutation） 移码突变（frame-shifting mutation）,碱基改变,点突变：DNA被化学修饰或复制时发生错配 ，使一个碱基变成另一个碱基。 碱基插入突变：DNA链中插入1个或多个碱基（转座子Tn），突变后可引起DNA序列阅读框架改变。 碱基缺失突变：DNA链中1个或多个碱基发生丢失，突变后可引起DNA序列阅读框架改变。,突变分类,基因突变的密码效应分类,同义突变：碱基被替代后没有密码子改变，其产物AA序列也无变化。 错义突变：碱基序列的改变引起AA序列改变。 无义突变：某个碱基改变使某个AA的密码子成为蛋白质合成的终止密码子。,缬氨酸 G U A,Hb中一条链 谷氨酸 G A A,基因突变的其他分类方式,形态突变,生化突变,致死突变,按突变的表型特征分类: 突变发生后出现的表型改变是多种多样的，有的可能十分微弱，需要精细的生化技术才能检测出与野生型（WT)的差别，有的突变的表型效应可能如此之大，以致产生形态上的严重缺陷甚至死亡。,1、形态突变(morphological mutation): 突变主要影响生物体的外在可见的形态结构，故又称可见突变。如形状、大小、色泽等的改变。 2、生化突变(biochemical mutations): 突变影响生物的代谢过程。导致一个特定的生化功能的改变或丧失。 （1）失去功能的突变：突变事件通常是破坏性的，多数情况下，突变事件导致功能的丧失，完全丧失基因功能的突变称为无效突变(null mutation) 。通常丧失功能的突变是隐性的，有时候也可以是显性的。 （2）获得功能的突变:突变事件引起的遗传随机变化有可能使之获得某种新的功能。,3、致死突变(lethal mutation): 影响生物体的生活力，导致个体死亡的一类突变。 条件致死突变(conditional lethal mutations)：在某些条件下能成活，而在某些条件下是致死的。例如T4噬菌体的温度敏感突变型在25时能在E.coli 宿主细胞中正常生长，形成噬菌斑，但在42 时就不能生长。,按发生突变的细胞分类,基因突变可以发生在体细胞或生殖细胞中，这两种突变有完全不同的后果。,体细胞突变,生殖细胞 突变,1、体细胞突变(somatic mutations): 在保持分裂的身体组织的一个细胞发生突变，这个细胞便成为一群相同突变细胞的祖先。在发育过程中，体细胞突变事件发生的愈早，对表型的影响就愈大。体细胞突变一般不能遗传给后代。 2、生殖细胞突变(germinal mutation) ：生殖细胞突变发生在种系(germ line)中。如果突变的性细胞参与受精过程，那么突变基因就会传给下一代。最典型的例子是性连锁遗传的血友病突变在欧洲王室通过维多利亚女王在其整个家系中的遗传。,二、突变诱因及特点,自发性突变 DNA复制过程中偶然碱基配对出现错误 ，突变频率低 (10-9 10-10) 。 诱变剂的作用 诱变剂（mutagen）外源诱发突变的因素，种类繁多，突变频率高，是自然突变的100-1000倍 。主要有以下几种：,突变诱因,（1）物理因素 ：紫外线、电离辐射等。 （2） 生物因素 ：病毒、真菌、细菌等 （3）化学因素 ： 烷化剂,碱基类似物 : 如5-BrU,5-BrU 引起DNA碱基 改变示意图,其他化学诱变剂: 羟胺、亚硝酸盐等,基因突变表现出以下几个方面的普遍特征： (一) 突变的平行性、重演性和可逆性 (二) 突变的多方向性与复等位基因 (三) 随机性生物个体发育的任何时期 体细胞突变 不遗传给后代 生殖细胞突变遗传给后代 (四) 广泛性和有害性（多数）,基因突变的一般特征,1.平行性 是指亲缘关系相近的物种因遗传基础较近似而发生相似基因突变的现象。 如小麦有早熟、晚熟的变异类型，属于禾本科的其它物种如大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米等同样存在这些变异类型。 2.重演性 相同的基因突变可以在同种生物的不同个体间重复发生，称为重演性。 同一基因突变在不同的个体上均可能发生。 不同群体中发生同一基因突变的频率相近。,突变的平行性、重演性和可逆性,3. 可逆性：基因突变的发生方向是可逆的。 正突变(forward mutation)：显性基因A隐性基因a ； 反突变(reverse mutation)： 隐性基因a显性基因A 。 通常认为：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突变往往是野生型基因突变而丧失功能、发生功能改变，表现为隐性基因。所以反突变又称为回复突变(back mutaiton)。 通常用u表示正突变频率、v表示反突变频率，则： 正突变u 野生型=突变型 一般 uv 反突变v,突变的多方向性：指基因突变可以多方向发生，即基因内部多个突变部位分别改变后会产生多种等位基因形式。 例如：A基因不同部位发生改变产生突变基因a1、a2、a3等对A均表现为隐性的基因。新基因可能均是无功能的，也可能各具不同功能。这些复等位基因可以从野生型基因突变产生，也可以从其它任何一个突变基因突变产生。,突变的多方向性与复等位基因,复等位基因(multiple allele)： 位于同一基因位点上的多种等位基因。 在二倍体与异源多倍体中，同一位点只能有一对基因，最多存在两种等位基因形式；因此复等位基因的各种形式会存在于生物群体的不同个体中。,等位基因概念,人类红细胞表面抗原的特异性由3个复等位基因IA，IB，i决定。 其中IA，IB对i均为显性； IA，IB间为共显性。 3种基因两两组合可能形成6种基因型、4种红细胞表面抗原反应类型，如下表所示(其中用IO表示i)：,人类ABO血型的复等位基因,三、基因突变与疾病,人类所有疾病均可视为基因病 按照参与疾病发生过程的基因性质和来源，基因病可分为三种：,Gene Mutations and Disease,基因型 genotype,表型 phenotype,正常/异常,单基因病,多基因病,获得性基因病,正常/异常,基因突变与疾病,代谢性疾病 神经肌肉系统疾病 发育缺陷 肿瘤 早老症,No Symptoms Severe Symptoms Mild Symptoms No Symptoms,Disease Inheritance is Complex,Searching Disease Families,血友病突变在维多利亚女王 及其整个家系中的遗传,突 变 与 疾 病,Tumor / Cancer,早 老 症,早衰症全称早年衰老综合症，又称儿童早老症，属遗传病。Hutchinson于1886年首先报告虽然本病为一种先天遗传性疾病，但还不能确定是常染色体隐性还是显性遗传。本病为一综合征，特点为发育延迟，至婴儿时期就发生进行性老年性退行性改变。患者身体的老化过程十分快速。而罹患此病孩童的年龄很少超过13岁，大约每八百万个新生儿之中有一位患有此疾。,赫-吉综合征(HGPS),日本京都大学灵长类研究所副教授大石高生的研究小组发现了年龄小但面相衰老的“早衰症”猴子，并将此发现发表在了美国科学杂志上。 该小组目标通过猴子细胞制造出的人工多功能干细胞(iPS)使机体各种细胞变异，体外再现早衰症病状，以此帮助衰老研究。大石教授表示“不仅希望揭开早衰症的病理，同样想要研究人类正常衰老的课题”。,2019/4/24,53,可编辑,着色性干皮病（XP）,着色性干皮病( xroderma pigmentosa XP)与共济失调毛细血管扩张症一样，属DNA修复缺陷所致的遗传性共济失调综合征。XP是常染色体隐性遗传病，具有遗传异质性。 着色性干皮病是一种发生在暴露部位的色素变化，萎缩，角化及癌变的遗传性疾病，属常染色体隐性遗传病。,21三体综合 症患儿 （先天愚型）,白化病患者,Duchenne肌营养不良症（假性肌肥大型）,唇裂与腭裂,Mitochondrial Mutator Mice Validate the mtDNA Mutation Theory for Mammalian Aging,研究基因突变与疾病关系时应注意的问题,致病突变与基因多态性：基因中某种突变在人群中发生频率1%，属于基因多态性，该突变为中性突变。发生频率1%则可能属于致病突变，但须首先确证在人群中只在病患个体出现该突变，其次是在病患家系中也只有患病者出现该突变。 单基因遗传疾病与主要基因突变有关，如碱基置换、插入、缺失等 多基因病涉及突变和候选易感基因数量众多 鉴定致病或与疾病相关的基因变异体是关键,常见病,稀有变异体,常见变异体,常见病,人类基因突变及疾病相关数据库,HMGD - Human Gene Mutation db SVD - Sequence variation db HGBASE - Human Genic Bi-Allelic Sequences db The SNP consortium dbSNP - Human single nucleotide polymorphism (SNP) db List of mutation databases from OMIM List of mutation databases from IMT (Finland) ADB - Albinism db (Mutations in human genes causing albinism) Alpha-glucosidase - Information about human acid alpha-glucosidase (GSD-II) AR mutations - Human androgen receptor mutation db Antithrombin mutation db Asthma and Allergy gene db,人类基因突变及疾病相关数据库,TSC - TSC (TSC1/TSC2) variation db TSC2 - Cardiff-Rotterdam Tuberous Sclerosis (TS) db (Tuberin; TSC2) TGDB - Tumor gene db VMD2 mutation - Human VMD2 mutation db vWF mutation - Human von Willebrand factor (vWF) mutation db WRN - Human WRN mutation db (Warner disease) WT1 mutation - Human WT1 mutation db X-ALD mutation - Human ABCD1 mutation db,人类基因突变及疾病相关数据库,OTCase - Human ornithine transcarbamylase (OTCase) website Cytochrome P450 alleles nomenclature p53 mutation db - University of Tokyo p53 mutation db Germline p53 mutation db - University of Prague db of germline p53 mutations PAHdb - Human phenylalanine hydroxylase (PAH) mutation db PAX6 mutation - Human PAX6 mutation db Prion - Prion and prion disease web site RAG1base - Human RAG1 mutation db RAG2base - Human RAG2 mutation db RB1base - Human retinoblastoma-associated protein (RB) mutation db RetNet - Retinal Information Network Retina International Scientific Newsletter - Information on Retinal genes, proteins and diseases,人类基因突变及疾病相关数据库,FBN1 mutation - Human fibrillin 1 mutation db (Marfan syndrome) G6PD - Human G6PD deficiency resource Galt mutation - Human galactose-1-phosphate uridylyltransferase mutation db (Galactosemia) HEXAdb - Human Hexosaminidase A mutation db (Tay-sachs disease) IL2RGbase - Human IL2RG (Interleukin-2 receptor gamma) mutation db (X-SCID) L1CAM mutation - Human L1CAM mutation db LDLR mutation - Human LDLR mutation db (Familial hypercholesterolemia) LQTSdb - Long QT syndrome db NCF1base - Human NCF1 mutation db NCF2base - Human NCF2 mutation db Neuromuscular diseases web site NCL - Neuronal Ceroid Lipofuscinoses mutation db,人类基因突变及疾病相关数据库,BIOMDB - Db of mutations causing tetrahydrobiopterin deficiencies BLMbase - Human BLM mutation db (Bloom snydrom) BTKbase - Human BTK mutation db (X-linked agammaglobulinemia) CD40Lbase - Human CD40 ligand mutation db COL1/3 mutation - Human Type I and III collagen mutation db CFTR mutation - Human cystic fibrosis mutation db (CFTR) EMD db - Human Emerin (EMD) mutation db (Emery-Dreifuss muscular dystrophy) KMeyeDB - Eye disease genes db FVII mutation - Human Factor VII mutation db HAMSTeRS - Human Factor VIII mutation db (Haemophilia A) HAeMB - Human Factor IX mutation db (Haemophilia B),定点突变技术 （想变就变）,定点突变：为了了解基因突变与其产物对个体表型的关系，有目的地在离体条件下制造位点特异突变。 定点突变技术广泛应用与基因表达调控、遗传和蛋白质工程研究 定点突变技术包括： 各种核酸酶和突变剂制造突变技术 寡核苷酸介导的定点突变 PCR定点突变,四、突变与遗传工程技术,基因会发生突变，突变可以自发也可以诱发。但在加拿大生物化学家M史密斯（1932-2000）发明定点突变法之前，突变株的产生必须经由自然界或用化学等方法诱使基因体突变，这种突变属于随机突变。 史密斯发明的定点突变法却是有目的的，该法可经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变。也就是说，这种突变是预先设定好的，所以也有人将该法称为“反遗传法“。 有意思的是，这一给生命科学研究及应用 领域带来革命性突破的方法，竟然是史密斯 和其同事在喝咖啡时闲聊出来的。 定点突变法不仅广泛用于基因工程领域，还 可用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医 学矫正遗传病、治疗癌症等。,定点突变,定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。 定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。,蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。 利用定点突变技术改造基因：如野生型的绿色荧光蛋白（wt GFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），且发光强度比原来强百倍，甚至出现黄色荧光蛋白（YFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)等。 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。,BAL31核酸酶消化产生单/双向突变体 _,BAL31是从海洋细菌Alteromonas espejiana sp中分离到的钙依赖性核酸酶。 BAL31有： 3 5外切核酸酶活性 从双链DNA去除单链核苷酸。 53外切酶活性，有效切割单链DNA。 消化单链DNA的内切酶活性。能缓慢切割多种扭曲的 DNA底物 两种外切酶活性使BAL31能消化DNA的两个末端以缩短双链,BAL31消化产生双向突变体,限制酶U消化产生线性质粒DNA,在不同时间点进行BAL31消化,已消化好的DNA片段重新环化,BAL31消化产生 单向突变体,限制酶A消化产生线性质粒DNA,在不同时间点进行BAL31消化,已消化好的DNA片段进行限制酶B消化,凝胶电泳纯化靶DNA片段,凝胶电泳纯化靶DNA片段,将消化的靶DNA重新克隆进新质粒载体,寡核苷酸介导的定点突变 _,TCAGGCT,杂交退火,DNA 聚合酶 （klenow）, 4dNTP,T4 DNA连接酶 ATP,转染大肠杆菌,用32P-标记的寡核苷酸做杂交探针筛选噬菌斑，分离突变体,寡核苷酸介导的定点突变,Kunkel 法,在dut-，ung- F大肠杆菌中培养重组 M13噬菌体，制备单链模板DNA,模板中尿嘧啶取代了胸腺嘧啶（20-30个尿嘧啶/模板）,磷酸化的诱变寡核苷酸,DNA聚合酶，dNTP，DNA连接酶,转染野生型大肠杆菌ung +,被尿嘧啶取代的DNA链被降解,由体外合成的DNA链所产生的噬斑,Kunkel 法总结,硫代磷核苷酸诱变法,原理：限制性核酸内切酶 Ava， Ava ， Ban， Hind， Nci， Pst，Pvu等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。 用硫代磷核苷酸如dCTPS 及dNTPs,在DNA聚合酶催化和DNA连接酶作用下，形成异源dsDNA分子，再用Nci消化该异源dsDNA分子，可获的高效率的定点突变分子。 特点：可获得很高的突变率（点突变，缺失和插入突变）,硫代磷核苷酸诱变法流程,杂交退火,TCAGGCT,硫化核苷酸， DNA聚合酶,1.Nci核酸酶 2.核酸外切酶,DNA聚合酶 和连接酶,转化并 筛选突变体,单点定点突变 Stratagene公司QuikChange Site-directed Mutagenesis kit,准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用Pfu Turbo聚合酶“循环延伸” (所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝)，正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。 DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开。,操作 流程图,后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。 QuikChange由于操作简单快速，效率高（ 80%）而受到普遍欢迎，光是2012年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。,多位点定点突变,在改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等研究过程中，单点突变不能满足实验的需要，重复进行单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。原理就是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒。这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。,PCR定点突变 _,重叠延伸PCR诱变 试验概要：扩增的DNA片段在预设突变处重叠(2次PCR)，再与两 个与原始片段互补的侧翼引物进行第3次PCR 特点：需两个突变诱导引物，两个侧翼引物，3次PCR。诱变率极高 大引物PCR定点诱变 试验概要：两轮PCR，2个侧翼引物，其中一个为预设突变引物，第一轮PCR后，大引物不需纯化，第一轮退火温度较低，第二轮较高（72） 特点：简单，经济，平均诱变效率可达80,PCR原理示意图,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PA,5,PB,PA,5,PC,PCR-1,PCR-1,PCR-2,PCR-2,混合，变性 ，退火,重叠延伸PCR定点突变,5,5,PCR-3,DNA 聚合酶,大引物PCR定点诱变,5,3,5,3,引物2,引物3,PCR产生大引物,引物1,突变体,PCR2,五、突变的检测,限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP） 单链构象多态性（ single-strand conformation polymorphism ,SSCP ） 等位基因特异性PCR （ allele specific PCR ） 毛细管电泳法（capillary electrophoresis） 测序（sequencing） DNA 芯片（chip）,PCR-RFLP: 多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理：PCR产物限制性内切酶切多态性分 析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。 优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好， 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗