基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展.pdf

基因组学与应用 生物学 ， 2 0 0 9年 ， 第 2 8 卷 ， 第 l 期 ， 第 1 5 3 1 5 8页 Ge n o m i c s a n d Ap p l i e d Bi o l o g y ， 2 0 0 9 ， Vo 1 2 8 ， No 1 ， 1 5 3 1 5 8 专题介绍 Re vi e w 基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展 孙兵 0 闫彩霞 z 张廷婷 2 郑奕雄 毕玉平 s 陈高 ，z 单世华 2 l 东北农业大学， 哈尔滨， 1 5 0 0 3 0 ； 2山东省花 生研究所， 青 岛， 2 6 6 1 0 0 ； 3仲恺 农业 工程 学院， 广州， 5 1 0 2 2 5 ； 4山东农科院高新技术研 究中心， 济南， 25 0 1 00 通 讯作者， s h h s h a n s i n a c o m 摘 要基因芯片是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码( 寡核苷酸、 e D NA、 基 因组 D N A等) 固定在玻 片、 硅片等 固相载体上组成的密集分子阵列 。基 因芯片技术本质是生物信号 的平行分析， 它利用核酸分子杂 交原理， 通过荧光标记技术检测杂交亲和与否， 再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高 通量、 微型化、 连续化、 自动化、 快速和准确等特点， 已引起国际国内广泛的关注和重视 ， 在许多领域得到 了广 泛 的应用 。本文简述 了基 因芯片的概念， 技术特点及主要分类 ， 着重对其在基 因表达水平检测 ， 基因突变和 多态性的分析， 基 因组 D NA分析 ， 后基 因组学研究 以及转基 因农作物检测等方面进行 阐述 ， 并说明其存在 的问题及展望。 关键词基 因芯片， 基因克隆， 植物 Re s e a r c h P r o g r e s s o f Ge n e Ch i p Te c h n o l o g y i n P l a n t Ge n e Cl o n i n g S u n Bi ng 。Ya n Ca i xi a Zha n g Ti ng t i n g Zhe ng Yi x i o ng Bi Yu p i ng Che n Ga o 。S ha n Sh i h ua l No r t h e a s t Ag r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ， Ha r b i n ， 1 5 0 0 3 0 ； 2 S h a n d o n g P e a n u t R e s e a r c h I n s t i t u t e ， Qi n g d a o ， 2 6 6 1 0 0 ； 3 Z h o n g k a i U n i v e r s i ty o f A g r i c u lt u r e a n d E n g i n e e r i n g ， Gu a n g z h o u ， 5 1 0 2 2 5 ； 4 Hi g h T e c h Re s e a r c h Ce n t e r ， S h a n d o n g Ac a d e my o f Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e s ， J i n a n ， 2 5 0 1 0 0 Co r r e s p o n d i n g a u t h o r ， s h h s h a n s i n a c o m Ab s t r a c t Ge n e c h i p s a r e i n t e n s i v e mo l e c u l a r a r r a y t h a t l o t s o f b i o l o g i c a l me s s a g e p a s s wo r d t a k e r o o t wi t h g l a s s s i l i c o n ， s u c h a s s o l i d p h a s e c a r ti e r b y p r e d e s i g n e d ma n n e r T h e p a r a l l e l a n a l y s i s o f b i o l o g i c a l s i gn a l s i s t h e n a t u r e o f g e n e c h i p t e c h n o l o g y ， i t d e t e c t s a ffin i t y o r n o t o f h y b r i d i z e b y fl u o r e s c e n t l a b e l i n g wi t h p r i n c i p l e o f n u c l e i c a c i d h y b r i d i z a t i o n ， i t c a n o b t a i n t h e n e c e s s a r y i n f o r ma t i o n q u i c k l y b y c o mp u t e r a n a l y s i s Du e t o t h e c h a r a c t e r i s t i c o f h i gh- t h r o u g h p u t ， mi n i a t u r i z a t i o n ， c o n t i n u o u s ， a u t o ma t e d ， r a p i d a n d a c c u r a t e ， b e c o me a r o u s e a w i d e r a n g e o f a t t e n t i o n i n t e r n a t i o n a l a n d d o me s t i c ， wi d e l y u s e d i n ma n y a r e a s W e o u t l i n e s t h e c o n c e p t ， t e c h n i c d l f e a tur e a n d t h e ma i n c l a s s i fi c a t i o n o f g e n e c h i p s i n t h i s p a p e r ， e mp h a s i z e d e t e c t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n ， g e n e mu t a t i o n a n d p o l y mo r p h i s m a n a l y s i s o f t h e g e n o me DNA a n a l y s i s ，p o s t g e n o mi c s r e s e a r c h a n d d e t e c t i o n o f g e n e t i c a l l y mo d i fi e d c r o p s ， a n d e x p l a i n i t s p r o b l e ms a n d p r o s p e c t s Ke y wo r d s Ge n e c h i p s ， Ge n e c l o n i n g ， P l a n t 基因芯片技术( g e n e c h i p t e c h n o l o gy) 是随着人类 基因组计划( h u ma n g e n o me p r o j e c t ， H GP ) 的进展而发 展起来的具有广阔应用前景的生物技术之一。1 9 9 5 年， S c h e n a等( 1 9 9 5 ) 在“ Na tur e ” 上首次发表基 因芯片 研 究的论文，之后基因芯片技术及其应用 的发展突 飞猛进 。美国的 F o d o r 等( 1 9 9 1 ) 在硅芯片表面涂布一 种光敏材料， 采用光蚀刻技术 ， 在光引导下原位合成 多肽链，受此启发，改进技术后合成了 D NA阵列 ， 1 9 9 6年底 ， 由他们研 制 的第一 块 DN A 芯片诞 生 了。基因芯片技术 是融微 电子学 、 生物 学、 物理学 、 化学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术， 利 用现代科技和 工艺将生物化学分析系统进行微缩， 变过去传统的多个、 不连续的分析过程为一个连续 的、 快速 的检测 分析过程 ， 既能节约 时间又能节省 试剂 费用 ， 一次可 以对 大量的生物分子进行检测分 析 ， 从而弥补传统核酸 印迹杂交( S o u t h e mb l o t t i n g和 基金项 目： 本研究由国家自然基金项目( 3 0 7 7 1 3 6 1 ) 和山东省农科院创新基金项 目( 2 0 0 6 YC X0 1 2 ) 资助 基 冈组学与应用 生物学 l 5 4 Ge n o mi c s a n d A p p l i e d B i 。 1 。 g y w w w g e n o a p p l b i o 1 o r g No r t h e r n b l o t t i n g等) 技术 复杂 、 自动化程度低、 检 测 目的分子数量少、 低通量等不足， 具有重大的基础研 究价值 ， 又有明显的产业化前景( 吴明煜等， 2 0 0 5 ) 。目 前基因芯片 已经不再局限于简单的测序，而是在植 物， 微生物 ， 食品等方 向都有广泛的应用。可 以用于 研究来源于不同个体、 不 同组织、 不 同细胞周期 、 不 同发育阶段 、 不同分化阶段、 不 同病变 、 不同刺激( 包 括不同诱导、 不同处理胁迫阶段) 下的细胞 内的 mR N A的表达丰度， 通过逆转录后产生的 c D NA与表达 谱芯片进行杂交 ，可 以对这些基 因表达的个体特异 性 、 组织特异性、 发育阶段特异性、 分化阶段特异性 、 病变特异性 、 刺激特异性进行综合的分析与判断， 研 究基因功能 以及 进一步研究基 因问相 互作用 的关 系。因此， 基因谱芯片可 以获得大量与研究领域相关 的基因， 从而使科研更具有 目的性和系统性 ， 同时也 拓宽了研究领域。 1基因芯片技术原理 1 1基 因芯片 的概念 基因芯片又称 D NA芯片 ( D NA c h i p ) 、 DN A微阵 列( D NA mi c r o a r r a y ) 、 D N A微 阵列芯片( D NA mi c r o a r r a y c h i p ) ， 是最常见的生物芯片( b i o c h i p ) 之一f 李凌和 马文丽， 2 0 0 0 ) 。 基因芯片技术是建立在基因探针和杂 交测序技术上 的一种高效快速 的核酸序列 分析 手 段。 将数 以万计的 D NA探针片段有序地固化于支持 物表面上 ， 产生二维 D N A探针阵列， 然后与标记的 样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样 品的快速、 并行、 高效地检测或诊断( 王升启， 1 9 9 9 ) 。 1 2基 因芯片 的技术特 点 基因芯片技术的特点的核心是微型化 。芯片每 平方厘米固体表面上可 固定 1 0 个 D N A 片段、 数万 个基因。 一次分析可得到数万个基因的表达信息。 微 型化的另一方面是样 品用量与试剂用量 的微量化 ， 用纳克级的 mR NA、微升级的杂交液就能分析成千 上万个基 因的表达信息。这些都是其它研 究技术所 无法比拟的f 许树成， 2 0 0 3 ) 。 芯片制作及分析过程易于 自动化。芯片设计制 作可实现 自动化 ，可根据要求将 需要分析的基因制 作成符合要求的芯片； 杂交、 洗片等过程都可实现 自 动化， 工作效率大幅提高。 1 3基 因芯片 的分 类 依据不 同的分类方法大致可分 以下几种 ： ( 1 ) 根 据探针载体基质不同分为无机片基基 因芯片 ，指其 基质基片是无机物， 如： 载玻片、 硅片等； 有机片基基 因芯片 ， 指其基质基 片是有机物如纤维素、 聚丙烯 尼龙膜等。 ( 2 ) 按点样方式根据芯片点样方式不同， 可 分为原位合成芯片( 1 o c i s y n t h e t i c D N A c h i p ) 、 矩阵芯 片( mi c r o a r r a y ) 、 电定位芯片( mi c r o e l e c t r o n i c ) 类。 ( 3 ) 按芯片使用功能分类生物芯片因功能和用途不同可 分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯 片等( 安利峰和胜利， 2 0 0 2 ) 。 2基 因芯片在植物基因克 隆中的应用 2 1研究 生物体 对逆 境的反 应 植物抗逆等基因的筛选是从分子水平上揭示植 物生理机制 的一项基础性研究，发现新基因是培育 抗逆新品种 的重要前提 ， 如寻找抗病虫、 抗旱、 耐寒 的相关基因， 以进行新产品的开发和 品种 的改 良等， 利用基 因芯片可以高通量、快速检测基 因的差异表 达( 张志刚等， 2 0 0 6 ) 。 S e k i 等( 2 0 0 2 ) 发现 ， 拟南芥受 旱胁 迫和冷胁迫 后，在 1 3 0 0个全长 c DN A中，有 4 4个受旱胁迫诱 导， l 9个受冷胁迫的诱导，有 1 2个是控制胁迫诱导 转 录 因子 D R E B1 A C B F 3的靶 向诱 导基 因( t a r g e t s t r e s s i n d u c e d g e n e 。T h i mm等( 2 0 0 1 ) 发现拟南芥幼 苗缺铁 3 d后， 参与糖酵解、 三羧酸循环、 氧化戊糖磷酸 途径的基因以及在根中参与无氧呼吸的酶 的基 因表 达量增加， 苗中参与葡糖异生作用( g l u c 0 n e o g e n e s i s ) 、 淀粉分解 、 韧皮部装载的基因也受到诱导表达 。Ma 等( 2 0 0 1 ) 发现 ， 拟 南芥幼苗被远红光、 红光和蓝光分 别照射后 ， 表达相似的调节基 因基本 占到整个基因 组的三分之一，其 中五分之一 的基因受到正调控 ， 五分之二 的基因受到负调控 ，共有 2 6个细胞途径 参与了光调节。 赵宝存等( 2 0 0 7 ) 用基 因芯片研 究小麦在不 同 盐胁迫时间下根部基 因的应答反应 ，获得了 6 1 2 1 5 个小麦基 因的差异表达 图谱 ，并发现在不同盐胁迫 时间下大量根部基因的表达发生很大变化，与对照 相 比，盐胁迫 1 h的材 料 中， 5 6 基 因上调表达 ， 1 2 4 基 因下调表达 ， 8 0 9 没有变化 ； 盐胁迫 6 h的 材料 中， 6 8 基 因上调 表达 ， 9 6 基 因下调表 达 ， 8 2 7 没有变化； 盐胁迫 1 2 h的材料 中， 6 _ 3 基因上 调表达 ， 1 0 1 基因下调表达 ， 8 2 6 没有变化 ；盐胁 迫 7 2 h的材料 中， 7 5 基因上调表达 ， 1 1 2 基 因下 调表达 ， 8 0 没有变化。 基 因芯 片技术在植物基 因克 隆中的应用研究进展 Re s e a r c h Pr o gr e s s o fGe ne Ch i p Te c h no l o g y i n Pl a nt Ge ne Cl o ni ng G u o等( 2 0 0 7 ) 采用 2 2 0 0 0个 E S T s的 Af f y me t r i x 大麦基 因芯片 B a r l e y l来分析生殖 生长 期干 旱胁 迫 下 T a d mo r ( 耐旱) 和 W 1 2 2 9 1( 干 旱敏感) 2种大麦材 料 的差异表达基 因， 结果表 明干旱胁迫下 2个大麦 材料 中有 7 7个共调节基 因，进 一步 比较 2个材料 差异表 达的基 因， 发现两材料之 间有 3 7 2个受干旱 调节基 因的差异 。王继 刚等( 2 0 0 8 ) 从此文库 中选取 部分克 隆构建 了草原龙胆基因芯片 ， 并利用其 分析 高盐胁迫下 的草原龙胆叶片基 因的表 达差异 ， 发现 在 3 h的高盐胁 迫下有 3 6个单一基因有差异表达 ， 大多数基 因未见报道 。 2 2基 因表 达水 平 的检测 用于基因表达水平检测的方法很多， 有 No r t h e m 杂交 、 R e a 1 t i me P C R、 mR NA 差异 显示 法 ， c D NA代 表性差异分析等方法。DN A芯片技术应用于基因表 达水平的检测的最大优越性是可 自动 、 快速 、 平行检 测 目的材料 中成千上万个基 因的表达情况f 阿茹娜和 吴岩。 2 0 0 4 ) 。 基因芯片将植物 已知基因固定于芯片上 ，将植 物某种生理状态下所表达 的 mR NA反转录为 c D NA 并作荧光标记 ， 然后和芯片进行杂交 ， 通过检测杂交 信号的强度来分析相关基因的表达丰度 。用基因芯 片进行的表达水平检测可 自动 、快速地检测 出成千 上万个基 因的表达情况。B e v a n等( 1 9 9 8 ) 采用拟南芥 基因组 内共 4 5个基 因的 c DN A 微 阵列( 其 中 1 4个 为完全序列 3 1 个 为 E S T ) ， 检测该植物 的根、 叶组织 内这些基 因的表达水平 ，用不 同颜色 的荧光素标记 逆转录产物后分别与该微 阵列杂交 ，经激光共聚焦 显微扫描 ， 发现该植物根和叶组织中存在 2 6个基因 的表达差异，而参与叶绿素合成 的 C AB1 基 因在叶 组织较根组织表达高 5 0 0倍 。 S c h a f f e r 等( 2 0 0 1 ) 使用 了含 有 1 1 5 2 1个拟 南芥 表达序列标签的微阵列来鉴 定 1 d内每隔 6 h基 因 表达水平 的变化 。 1 1 的基因具有高水平和低水平循 环型表达， 同时鉴定了只被生物钟调控的基 因群体 。 同时，植物在不同的环境条件下表达的基 因是不同 的，而顺式作用因子和反式作用元件 的相互作用是 基因表达体调控 的重要方式 。通过基 因芯片技术可 以对逆境诱导下产生的反式作用因子 的基因进行研 究， 对于全序列测序 已经完成 的植物， 还可以通过其 基因组与全长 c D N A的对比得到的信息研究逆境诱 导的基因的启动子 。 B o R o n 等( 2 0 0 8 ) 用小麦基因组芯片对小麦叶 锈病 抗性基因 L r 3 4在代谢途 径 中表达变化 的研 究 中发现 ， L r 3 4基 因在代谢过程 中需要多种代谢途径 提供大量生物 能才可保证基因的转录活性 ，该基 因 才可达到抗病的表达水平 ， 同时解释 了 L r 3 4在抵抗 小麦叶锈病时受环境与时间的影响的原因。 G u t s c h e等( 2 0 0 8 ) 3 0 用大 麦基 因组芯 片分析 了 在 大麦 收获前对蚜 虫高抗 品种 与高感 品种进行蚜 虫处理后基 因的表达差异 ， 发现共有 9 0 9个基 因在 两 品种之 间成显著差异表达， 其 中两个过氧化物酶 H v P R XA1 和 H v P R X A2在抗 性 品种 中上调表 达很 明显 ， 证明了 R OS s c a v e n g i n g酶对抵抗蚜虫具有重 要意义 。 高志勇( 2 0 0 7 ) 成功地应用基 因芯片检测 了水稻 孕穗期不同器官的基 因表达，发现通 常认为主控花 形态建成 的 MADS 2 b o x基因家族 中 MA D S 1 4基 因， 在 水 稻 孕 穗 期 同 时 也 在 叶 和 根 中强 烈 表 达 ， 而 MA D S 1 5基 因则仅在 叶中表达 ； 同时还发现 NA C基 因家族 Z i n c基 因家族和 E S T均有基 因在水稻幼穗 ( 花) 中表达 ， 说 明水稻花所涉及的基因已经远远超出 了“ 花 发育 A BC模型 ” 所涉及 的 MADS 2 b o x基 因， 这些发现极大地丰富 了对 MADS 2 b o x 、 NAC、 Z i n c基 因家族 以及 E S T基因在植物体生长发育中作用的认 识 ， 为功能基因组学 的进一步研究奠定了基础。 2 3基 因突 变和 多态 性分 析 基因突变是顺序上 的核苷酸发生了改变，其突 变将会引起相应基 因的功能丧失或改变 ，引起遗传 病。芯片用于检测分子突变， 可以准确地确定突变位 点和突变型 ，芯片可 以同时检测多个基因乃至整个 基 因组的突变， 还可以进行基因多态性分析。尽管有 关植物突变性和多态性检测的报道较少，但研究突 变性和多态性对检测与防治植物疾病 ，探 究分子突 变与环境 的关系 ，促进植物育种和植物新 品种的产 生等有积极意义( 李克勤等， 2 0 0 4 ) 。 C o r a m 等( 2 0 0 8 ) IJ 用 5 5 K的小麦基 因芯片来检 测 E L P s 和 S F P s在两近缘基 因型小麦 B C 、 F 4 的表 达水平 ，目的是为了对抗锈病基 因 进行遗传标 记，结果表 明其中 9 1 个探针包含 E L P s ， 1 1 8个包含 表现 S F P s ， 而只有 9个 E L P s同时包含 S F P s ， 他们大 部分都分布在 2 L( Y r 5基因所在染色体) 与 2 S染色 体上 ，在染色体位点分析中 E L P s 和有 S F P s 很高的 相似 性， 分别为 0 3 0 和 0 3 9 ， 这两种多态型的强 相关性表 明 E L P s可能通 过顺式 DN A 多态性 的调 节 ， 9个 E L P s中有 4表现 为 多形 态 C AP S标 记在 基 因组学与应用 生物学 1 5 6 Ge n 。 mi c s a n d Ap p l i e d Bi O 1 O g y 、 )l r g e n o a p p l b i o 1 o r g Y r 5与 y r 5 i s o l i n e s 之间， 其中一个是在染色体 5 3 c M 与 y r 5位点之间。 2 4基 因组 D NA序 列分析 基因芯片技术用于序列分析提 出最早 ，原理是 依据短的标记寡核苷探针与靶 D N A杂交 ， 利用杂交 谱重建靶 D NA序列( 李淼等， 2 0 0 3 ) 。 它可一次测定较 长 的 DN A序列 ， Be v a n等( 1 9 9 8 ) 对拟南芥第 4染色 体上的 1 9 Mb片段进行 了全序列测 定， 结果发现拟 南芥基 因组中平均每 4 8 k b就有 一个基 因存在 ， 而 且 5 4 的基因与 Ge n B a n k中已知功能的基因有 同源 性， 5 6 的基因可 以与 G e n B a n k中的 E S T相对应， 大 约 2 0 的基因在该染色体片段上以基因家族的形式 存在 。另外，在该染色体片段 中共发现 5种重复成 分： 非编码区中的重复 D N A序列、 反逆转座子成分 、 叶绿体 D NA片段、 散布重复 的基因家族成员， 以及 串联重复的基因家族成员，这些重复成分约 占所测 序列的 1 9 左右。 植物基因组序列的测定，将有助于了解基 因表 达模式、 基因突变和多态性， 发现新基 因以及克隆特 异性基因， 也将促进植物功能基因组的研究( 洪丽亚 和黄儒珠， 2 0 0 2 ) 。 2 5利用 基 因芯 片技 术进行 后基 因组 学研究 基因预报和功能鉴定是测序和对基因组进行注 释 的结果， 基因组测序完成后， 研究未知基 因的功能 是一个十分 引人 的后基 因组研究课 题( 徐 炳森等， 2 0 0 0 ) 。S t a n d f o r d大 学的 D a v i s 研究小组利用 D NA 芯片对酵母缺失突变株进行定量分析以确定酵母全 序列完成后新发现的 OR F的生物学功能。应用基因 打靶技术产生许多个 O R F缺失突变株酵母， 并在缺 失 OR F旁侧引入 2 0个核苷酸的标志序列作为缺失 O R F的身份标志， 即所谓的“ 分子条形码” 。分子条形 码可与 D N A芯片上的探针杂交，以便于筛选。这样 O R F功能测试可通过一次杂交及用同一生长培养条 件完成， 大大提高 了效率和准确性 。说明作物基因组 中未知功能的 O R F可用 D NA芯片来探明， 这在作物 育种上具有重大应用价值( 李喜焕等， 2 0 0 3 ) 。 美国加州大学河滨分校的研究人员与 Aff y me t r i x 公司合作设计 出一种称为 G e n e C h i p柑桔基 因组芯 片( c i t r u s g e n o me a r r a y ) 的新型芯片。 这种芯片能够促 进柑桔类植物 的多样性并因此 为人类更好地操纵它 们提供 了途径。例如， 通过帮助确定出在一种柑桔组 织中被开启的基因或者与味道、酸度和植物病害有 关的基 因，这种芯片能够提供对研究人员矫正柑桔 品质问题非常有帮助的信息。 这种柑桔芯片将会被用于开发新的改善柑桔种 植和收获后果实处理的新诊断工具 ，并且还有助于 研究人员了解柑桔病害的病因。研究人员将会研究 与柑桔产业有关的特性 ， 例如容易拨皮 、 无籽、 风味、 害虫和疾病控制 、 营养成分和产量 。 2 6转基 因农产 品检 测 广泛收集用于转基因技术的启动子 、目的基 因 ( 如抗病基因、 抗虫基 因等) 和标记基 因的 E S T序列， 制 成基 因芯片 ，可 以对 转基 因农产 品进行 检测 。 S u z u k i 等( 2 0 0 5 ) 使用寡聚核苷酸微 阵列分析了携带 3 5 S ： V P 1 的拟南芥转基因植株。用基因芯片分析鉴定 了3 5 3 个 V P 1 A B A调控的基因。这些基因中的 7 3 在植物组织中受 VP 1 和 A B A的影响， 这显示了 A B A 信号传导和 V P 1 功能之间的紧密联系。S i n v a n y Vi l 1 a l o b o等( 2 0 0 4 ) 用 7 0 一 me r 的寡核苷酸微阵列研究 了拟南芥线粒体和 叶绿体 中多基因家族成员在不同 的生长条件刺激下的转录变化情况 。 周萍萍等o o 8 ) 根据大豆 中所转入 的外源基因， 选择 c a mv 3 5 S启动子、 n o s终止子和 c p 4 e p s p s 基 因， 以大豆 内源基因 l e c t i n 基因为内参照基因设计了引物 和探针， 通过多重 P C R对样品核酸进行扩增和荧光标 记后 ， 将 P C R产物与基因芯片杂交， 检测转基因含量 不同的 R RS标准参考物检测灵敏度均可达 0 4 5 。 3存在 的问题及展望 基因芯片技术仍然处于发展阶段，要发展成 为 实验室普遍采用 的技术仍有一 些关键 问题亟待解 决： ( 1 ) 相 比 No r t h e r n b l o t 或 R T P C R， 不 能检测微量 mR NA。( 2 ) 荧光标记不均一， 灵敏度低。( 3 ) 制作程序 复杂 ， 样品处理繁琐 ， 成本高。( 4 ) 杂交条件高度个体 化， 难以形成统一的标准。随着芯片技术的不断成熟， 很多问题正在逐步解决( 常胜合等， 2 0 0 4 ) 。如 D N A合 成方法的改进 ，现 已允许更长 的寡核苷酸探针用于 点阵芯片。探针的构造变得简化， 没有了 P C R的扩 增， 仅要求清洗 。这 同时提高了杂交的一致性、 批处 理的一致性和点阵的一致性。为了使每一个样 品杂 交的费用降到最低 ， 现在多采用单染色 。因此 ， 越来 越多 的 c D N A 芯片的研究转 向于寡核苷酸 芯片 的 研究。 另一个改进方 向是采用 8 x 1 2 c mz 的标准微型 基片( 陈志和 曾照芳， 2 0 0 6 ) 。通过机器人分配液体 ， 9 6 个样品从准备、 扩增、 标记 、 清洗及杂交都可 以同 基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展 Re s e a r c h P r o g r e s s o f Ge n e Ch i p T e c h n o l o g y i n P l a n t Ge n e Cl o n i n g 时 自动处理 ， 即形成缩微芯片实验室( 1 a b o n a c h i p ) 。 再进一步结合卫星传输和网络生物信息学的资源 ， 真正实现高通量、 一体化 、 移动性的“ 未来 型掌上 实 验室 ， ( 赵雪松和马丹丹， 2 0 0 4 ) 。 基因芯片发展方 向包括 以下几个方面：第一 ， 现 在 e D NA芯片需要 大量 的 R N A ( 1 O g总 R NA 或 5 0 0 n g的 mR NA) ， 因此必需改进 R NA的扩增方法以 分析更 小量的 R NA，最终进行单细胞表达分析； 第 二， 需发明新的更敏感 的信号检测系统； 第三， 芯片制 备、 样品处理、 杂交、 检测 以及数据分析的标准化， 提 高基因芯片的准确性和可靠性。 尽管基因芯片技术还 存在很多问题 ，但 由于其具有并行化和高通量 的特 点， 它的应用前景仍十分广阔。 最近几年， 基因芯片技 术有了很大的进展 ， 目前该技术对样品的需要量非常 少， 效率高， 能同时分析数千种作为遗传 、 基 因组研究 或诊断用的 D NA序列，更好地解释基因之间表达的 相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点。 基 因芯片技术在植物上 的应用前景无疑是非常广阔的， 如对基因功能、 植物生理机制、 农业发展 、 农业食品卫 生、 环境污染监测的研究与探讨等方面 。 参考文献 A R N ， a n d W u Y ， 2 0 0 4 ， Re c e n t a d v a n c e me n t i n b i o c h i p a n d i t s a p p l i c a t i o n ， Ne i me n g g u Yi x u e y u a n X u b a o ( Ac t a A c a d e mi a e Me d i c i n a e Ne i mo n g o 1 ) ， 2 6( 3 ) ： 2 2 7 2 3 2 ( 阿茹娜 ， 吴岩， 2 0 0 4 ， 生物芯片应用研 究进 展， 内蒙古医学 院学报 ， 2 6 ( 3 ) ： 2 2 7 - 2 3 2 ) An L F ，a n d S h e n g L ，2 0 0 2 ，Ge n e c o r e an d i t s a p pl i c a t i o n p r o g r e s s ， X i b e i Mi n z u X u e y u a n Xu e b a o ( J o u r n a l o f No r t h w e s t Mi n o r i t i e s U n i v e r s i t y( Na t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) ) ， 4 4 ( 6 ) 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a l me K ， Be n e s V ，Re c h ma n S ， An s o r g e W ， Co o k e R ， Be r g e r C ， De l s e n y M ，Vo e t M ，Vo l c k a e r t G ， Me we s H W ， Kl o s t e r ma n S ，S c h u e l l e r C ，a n d Ch a l wa t z i s N ， 1 9 9 8 ， An a l y s i s o f 1 9 Mb o f c o n t i g u o u s s e q u e n c e f r o m c h r o mo s o me 4 o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a ， Na t u r e ， 3 9 1 ( 6 6 6 6 ) 4 8 5 4 8 8 Bo l t o n M D ，Ko l me r J A ，Xu W W ，a n d Oa r v i n D F ，2 0 0 8 ， L r 3 4 me d i a t e d l e a f r u s t r e s i s t a n c e i n wh e a t ： t r a n s c r i p t p r o fi l i n g r e v e a l s a h i g h e n e r g e t i c d e ma n d s u p p o r t e d b y t r a n s i e n t r e c rui t me n t o f mu l t i p l e me t a b o l i c p a t h wa y s ， Mo 1 P l a n t Mi c r o b e I n t e r a c t ， 2 1 ( 1 2 ) ： 1 5 1 5 1 5 2 7 Ch a n g S H ，S h u H Y ， Li B ，Yi n g J ， an d L i Z S ，2 0 0 4 ，Ad v a n c e s i n b i o c h i p t e c hno l o g y ， S h e n g w u Xi n x i x u e( B i o i n f o r ma t i o c s ) ， l 0 ( 3 ) ： 3 1 3 4( 常 胜合， 舒海 燕， 李滨， 英 加， 李振 声， 2 0 0 4 ， 生物芯片技术研究进展， 生物信息学， 1 0 ( 3 ) ： 3 1 - 3 4 ) Ch e n Z ， a n d Ze n g ZF ，2 0 0 6 ， T h e l a t e s t d e v e l o p m e n t s o f g e n e c h i p t e c h n o l o g y ， G u o j i J i any a n Yi x u e Z a z h i ( I n t e ma - t i o n a l J o u r n a l o f L a b o r a t o r y Me d i c i n e ) ， 2 7 ( 3 ) ： 2 4 9 - 2 5 1 ( 陈 志， 曾照芳， 2 0 0 6 ， 基 因芯 片技 术的最新进展， 国际检验 医 学杂志， 2 7 ( 3 ) ： 2 4 9 2 5 1 ) Co r a m TE ， S e tt l e s M L ， W a n g M ， an d Ch e rt X ， 2 0 0 8 ， S u r v e y - ing e x p r e s s i o n l e v e l p o l y mo r p h i s m an d s i n g l e - f e a t u r e p o l y - mo r p h i s m i n n e a r - i s o g e n i c wh e a t l i n e s d i ffe rin g f o r t h e Yr 5 s t r i p e r u s t r e s i s t a n c e l o c u s ， T h e o r A p p 1 G e n e t ，1 1 7 ( 3 ) ： 4 01 411 F o d o r S P ， Re a d J L ， P i m mg M C， S t r y e r L ， L u A T ， an d S o l a s D ， 1 9 91 ，Li g h t d i r e c t e d ， s p a t i a l l y a d d r e s s a b l e p a r a l l e l c h e mi c a l s y n t h e s i s ， S c i e n c e ， 2 5 1 ( 4 9 9 5 ) ： 7 6 7 7 7 3 Ga o Z Y ， 2 0 0 7 ， Ap p l i c a t i o n o f g e n e c h i p i n d e t e c t i o n o f g e n e e x - p r e s s i o n o f fi c e ， An h u i No n g y e K e x u e( J o u ma l o f A n h u i A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ) ， 3 5 ( 1 0 ) ： 3 0 0 7 3 0 0 8( 高 志勇， 2 0 0 7 ， 应 用基 因芯片检测水稻基 因表达 的研 究， 安徽农业科学， 3 5 ( 1 0 ) ： 3 0 0 7 - 3 0 0 8 ) Gu o P G， Ba u m M， L i R H， Gr a n d o S ， Vars hn e y Rk ， Gr an e r A ， Ce c c are l l i S ， a n d Va l k o t m J ， 2 0 0 7 ， Tr a n s c r i p t i o n a l a n a l y s i s o f b a r l e y g e n e s i n r e s p o n s e t o d r o u g h t s t r e s s a t t h e r e p r o d u c t i v e gr o wt h s t a g e u s i n g a f f y m e t fi x Ba r l e y 1 g e n e c h i p ， J o u r - n a l o f G u ang z h o u U n i v e r s i ty (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) ， 6 ( 5 ) ： 3 6 4 1 ( C h i n e s e J o u r n a l i n E n g l i s h ) Gu t s c h e A ， He n g - M o s s T ，S a r a t h G ， Twi g g P ， Xi a Y ， Lu G ， a n d M o r n h i n we g D ， 2 0 0 8 ， Ge n e e x p r e s s i o n p r o fi l i n g o f t o l e r ant b arl e y i n r e s p o n s e t o D i u r a p h i s n o x i a( He m i p t e r a ： A p h i d i d a e ) f e e d i n g ， B u l l E n t o mo l R e s ， 8 ： 1 - 1 1 Ho n g L Y， a n d Hu a n g R Z 2 0 0 2 ， Ge n e c h i p t e c h n o l o g y an d i t s a p p l i c a t i o n i