免疫组化方法和步骤.doc

免疫组化检测CD34+的表达 1基本原理免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。威斯腾生物 400-675-6758（1）1PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），11515 min；（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 15 min；（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 水箱中3 h多，再放入4 保存。（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）；（7）DAB工作液（临用前配制，5ul 20DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）（8）20 g/ml Proteinase K工作液（按1：500稀释贮存液1 mg/ml）。（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。2主要仪器设备电热压力蒸汽消毒器(XDD)浙江绍兴医疗器械总厂超净工作台 苏州净化设备公司TC2323型CO2恒温孵箱 美国SHEL LAB 公司恒温烤箱 上海跃进医疗器械厂高速台式离心机(BACKMAN CS-15R)美国Beckman公司抽滤器( AUTOSCIENCE AP-01) 上海磁力搅拌器(79-1) 江苏江阴科研器械厂0.22um纤维素滤膜 德国BM公司0.45um混合纤维素滤膜 德国BM公司1/10000电子天枰(Sartorius AC-211)德国细胞培养瓶及细胞培养板(Costar)美国细胞计数板上海医用仪器厂光学显微镜(OLYMPUS CK-40) 日本倒置显微镜（OLYMPUS) 日本照像系统(OLYMPUS BH-2)日本切片机： 德国Leica展片机： 德国Leica，HI1210型烤片机： 德国Leica，HI1220型3实验方法3.1载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。1. APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留2030秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。2. HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留12分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。3. Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。3.2常用酶消化：1） 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%，消化时间为37、1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2） 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37、30180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为210 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。3.3抗原热修复可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。3.3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在9298之间并持续1015分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却1020分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热56分钟后），计时12分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟3，下接免疫组化染色步骤。3.3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达9298起开始计时1520分钟，然后端离电炉，室温冷却2030分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.3 免疫组化染色步骤：1、石蜡切片脱蜡，100%二甲苯10minX 2,50%二甲苯 5min。2、复水：无水乙醇 5minX 2；95%乙醇5min；90%乙醇5min；80%乙醇5min；70%乙醇5min，蒸馏水洗涤5min。3、3%H2O2室温孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。4、PBS浸泡5分钟3次5、抗原修复：加入0.2%Triton X-100室温下4分钟，弃去液体，0.5%Triton X-100室温下10分钟，PBS冲洗，5分钟3次。6、6正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育20分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。7、PBS浸泡5分钟3次。8、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37孵育30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育30分钟。9、PBS冲洗，5分钟3次。10、 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育1030分钟。11、 PBS冲洗