刘伟氧化应激抑制IGF-1神经保护作用的机制及对策的研究.ppt

氧化应激抑制IGF-1神经保护作用的机制及对策的研究,同 济 医 院: 刘 伟 导 师: 常立文 教授 李维华 教授,华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 American Heart Association资助项目 Indiana Spinal Cord and Brain Injury Research Fund资助项目,背 景,大脑的缺氧缺血仍然是造成严重脑损伤的主要原因之一,20%死亡，高达40%幸存者遗留严重的神经系统后遗症,迄今仍无十分有效的临床手段能减轻脑损伤和改善预后,由于新生脑组织不成熟，使其对缺氧缺血反应更为敏感,背 景,IGF-1可促进神经细胞生存、分化、增殖、突触外伸已经髓鞘形成,然而若干瓶颈阻碍了IGF-1进一步试用于临床,在新生大鼠模型，即使在缺氧缺血发生后立即心腔内注射大剂量IGF-1，脑损伤仅能减少40%左右,缺氧缺血后延迟（6h以后）给予IGF-1治疗效果不清楚,IGF-1对脑和行为学发展的远期效果不明了,背 景,我们前期研究发现缺氧缺血后24和48h皮下注射IGF-1可显著减轻缺氧缺血诱导的不成熟鼠脑损伤，并在2个月后明显改善它们的记忆和认知行为发展（Zhong,J.Neurological Research,2009）,那么，这些新的发现提出一个问题：？为什么在缺氧缺血后立即投与IGF-1疗效不如延迟治疗明显,由于缺氧缺血后大量ROS的立即产生，我们猜想，正是这种氧化应激状态诱导了神经细胞对IGF-1的抵抗,背 景,我们进一步考虑是否能够在加入IGF-1之前加入一种抗氧化剂，以恢复神经细胞对IGF-1的敏感性,我室前期的研究证实，在缺氧缺血发生后，体外培养的神经细胞会立即产生大量的ROS（J.Zhong, W-H.Lee. Neurochemistry International.2007(51):398-404）,背 景,那么，这种抗氧化剂最好能满足以下条件：,本身没有毒副作用，不会对细胞造成新的损伤 能够很容易的进入细胞内，在胞内胞外均能发挥作用 具有良好的抗氧化功能，能够清除ROS，消除缺氧缺血 发生后的氧化应激状态 与IGF-1有协同作用，能够恢复细胞对IGF-1的反应性， 增强IGF-1对缺氧缺血后细胞的保护作用,目 的,通过建立新生大鼠神经元细胞氧化应激的模型,阐明氧化应激诱导神经细胞产生IGF-1抵抗的机制 找到一种理想的抗氧化剂，联合应用能够在氧化应激状态下增 强IGF-1对神经细胞的保护作用,第 一 部 分,氧化应激对IGF-1诱导不成熟大脑皮层神经细胞生存信号的影响,实验分组 24h内的新生SD大鼠，取大脑皮层，分别培养神经元细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞，并分别给予不同的处理条件 、不同浓度的H2O2处理组 、不同浓度的IGF-1处理组 、不同浓度的H2O2+IGF-1处理组 和处理时间：45min、2hour和4hour,材 料 和 方 法,材 料 和 方 法,LDH法检测细胞的死亡,MTT法检测细胞的存活,Western blot检测各种蛋白的表达,数据统计,采用SPSS11.0软件进行方差分析、检验,图1-1,1-2 H2O2对神经元细胞、少突胶质细胞和 星形胶质细胞LDH和MTT的影响,与少突胶质细胞和星形胶质细胞比较，P0.01，n=8，结果重复3次,结 果,一、大脑皮层神经元细胞对氧化应激损伤异常 敏感,图2-1,2-2 不同浓度H2O2对皮层神经元细胞LDH和MTT 的影响,n=4，结果重复3次,图2-3 不同浓度H2O2对皮层神经元细胞Caspase-3表达的 影响,n=8，结果重复3次,二、H2O2对皮层神经元细胞的毒性作用呈 剂量依赖性,结 果,图3-1 不同浓度IGF-1对皮层神经元细胞LDH的影响,与未加IGF-1组比较，P0.05，n=8，结果重复3次,图3-2 IGF-1对皮层神经元细胞Caspase-3表达的影响,与未加IGF-1组比较，P0.01，n=8，结果重复3次,结 果,三、IGF-1对皮层神经元细胞的凋亡具有 保护作用,图4-1,4-2 不同H2O2浓度下加入IGF-1对皮层神经元细胞 LDH和MTT的影响,n=4，结果重复3次,图4-3 不同H2O2浓度下加入IGF-1对皮层神经元细胞 Caspase-3表达的影响,Caspase-3,Cleaved Caspase-3,H2O2(uM) 0 20 40 60,IGF-1(ng/ml) 0 25 0 25 0 25 0 25,与未加IGF-1组比较，P0.01，n=8，结果重复3次,结 果,四、高浓度H2O2能够抑制IGF-1对皮层神 经元细胞的保护作用，即H2O2诱导神 经元细胞的IGF-1抵抗,图5 氧化应激状态下，加入不同浓度IGF-1对皮层神经元 细胞LDH的影响,与未加IGF-1组比较，P0.05，P0.01，n=4，结果重复3次,结 果,五、提高IGF-1的浓度并不能克服H2O2诱 导的皮层神经元细胞IGF-1抵抗,图6 高浓度H2O2阻断IGF-1对皮层神经元细胞P- Akt(ser473)表达的影响,P-Akt(ser473),Akt,H2O2(uM) 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80,IGF-1(ng/ml) 0 0 0 0 0 25 25 25 25 25,n=8，结果重复3次,结 果,六、IGF-1通过激活皮层神经元细胞生存信 号通路P-Akt(Ser473)，但是这一过程 能被高浓度的H2O2阻遏,第 二 部 分,丙酮酸钠恢复氧化应激状态下神经细胞对IGF-1信号的敏感性,实验分组 同第一部分,材 料 和 方 法,Western-blot检测各种蛋白的表达,方法,LDH法检测细胞的死亡,采用SPSS11.0软件进行方差分析、检验,数据统计,图7 氧化应激状态下，IGF-1和丙酮酸钠对皮层神经 元细胞P-Akt(ser473)表达的影响,P-Akt(ser473),Akt,H2O2(uM) 0 0 0 0 60 60 60 60 80 80 80 80,与前三种处理因素比较,P0.01 ，n=8，结果重复3次,IGF-1(ng/ml) 0 25 0 25 0 25 0 25 0 25 0 25,Sodium Pyruvate(mM) 0 0 2 2 0 0 2 2 0 0 2 2,结 果,七、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能使大脑皮 层神经细胞恢复对IGF-1的敏感性,图8 氧化应激状态下，丙酮酸钠对皮层神经 元细胞LDH和活化Caspase-3表达的影响,Caspase-3,Cleaved Caspase-3,H2O2(uM) 80 80 80 80,IGF-1(ng/ml) 0 25 0 25,Sodium Pyruvate(mM) 0 0 2 2,在未加H2O2组，与未处理组比较，P0.05，80uM H2O2组，与处理组比较， P0.01 ，n=4，结果重复3次,与未处理组比较,P0.01 ，n=8，结果重复3次,结 果,八、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能够减少大脑 皮层神经细胞的死亡,小 结,丙酮酸钠能够有效清除ROS，恢复AKT自身活性以及AKT对IGF-1的反应性，从而