几种工业酶制剂-精品.ppt

第九章 几种工业酶制剂,/ticket/?fafrom=%CE%E4%BA%BA&fato=%BA%BC%D6%DD&fadate=2009-10-26,第一节 碳水化合物酶（一）,一、-淀粉酶 (一）性能：无规则地水解淀粉内部的-1，4糖苷键，产物为葡萄糖、麦芽糖和糊精的混合物. 因产物的末端葡萄糖残基中C碳原子为构形，故称为淀粉酶,一般淀粉酶在pH值为5.58.0时活性较稳定，pH值小于4时，酶易失去活性但有些淀粉酶是偏酸性或偏碱性的，如黑曲酶生产的淀粉酶最适合的pH值为4，在pH值为2.5、温度为40时，处理30min后仍有一定的活性，但在pH值为7、温度为55，处理15min，淀粉酶几乎失活。而用米曲酶生产的淀粉酶则相反，在pH值为7、温度为55时，处理15min，酶活性无损失，但在pH值为2.5时，酶的活性完全消失。 目前所用的淀粉酶主要有耐中温(6070)和耐高温(90-95)根据酶反应动力学分析，温度每升高10，反应速度提高12倍，故耐高温。,目前所用的淀粉酶主要有耐中温(6070)和耐高温(90-95)根据酶反应动力学分析，温度每升高10，反应速度提高12倍，故耐高温。 淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势淀粉酶是一种金属酶，Ca2+使淀粉酶保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性除Ca2+外，其它二价碱金属离子Ba2+、Mg2+等也有维持淀粉酶活性的作用耐中温淀粉酶为适应生产工艺的高温条件，有时需添加Ca2+等稳定剂，但耐高温淀粉酶在Ca2+浓度很低时，稳定性就很好。在实际使用时，不需添加Ca2+等稳定剂。,（二）真菌淀粉酶生产菌株诱变选育路线图谱 出发菌株米曲霉2197 产酶148u/g 紫外线 突变株米曲霉ZLA16 产酶324u/g 硫酸二乙酯 突变株米曲霉ZLB35 产酶416u/g 钴60射线 突变株米曲霉ZLC06 产酶685u/g 微波 突变株米曲霉ZLD14 产酶788u/g 亚硝酸 突变株米曲霉ZLE09 产酶801u/g 离子束 突变株米曲霉ZLF13 产酶946u/g,三、工业生产,1、固体发酵 斜面菌种三角瓶种子 种曲 接种发酵麸曲（粗酶）烘干粗酶制品 原料蒸煮扬凉 超滤浓缩稀酶液 乙醇沉析 过滤酶泥（饼） 低温烘干 标准化成品,2、液体深层发酵,斜面菌种三角瓶种子（孢子悬浮液） 种子罐 接种 发酵罐 补料罐,热处理粗酶制品 盐析 压 滤 干燥 粉碎 混粉成品 标准化成品,二、葡萄糖淀粉酶（糖化酶）,（一）基本性能 又称淀粉葡萄糖苷酶，糖化淀粉酶，糖化酶，-淀粉酶。淀粉酶的一种。可从淀粉分子的非还原性末端依次切断-1,4葡萄糖苷键，逐个生成葡萄糖。也能水解支链淀粉中分支点的-1,6葡萄糖苷键，但水解速度较慢。,糖化酶是采用现代生物技术生产的生物制剂。产品最适作用PH4.0-4.2，适宜于PH范围PH3.5-5.0，最适作用温度58-60。存在于霉菌、细菌、酵母中。常用的生产菌是霉菌，如根霉、曲霉、拟内孢霉、黑曲霉、红曲霉等。是一种应用广泛、生产量最多和酶产品。用途：该产品广泛用于生产白油、黄酒、酒精、啤酒、乳酸钙作糖化剂；用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素，有机酸、氨基酸、维生素的发酵，还大量用于生产各种规格的葡萄糖。,（二）工业生产,制备方法：以黑曲霉变异菌株经发酵制得的高效生物催化剂。 1、菌种：黑曲霉变异菌株 2、种子制备 3、发酵 4、提取各制剂 （三）用途,（三）用途 主用作糖化剂,大米浸泡水洗磨浆调浆（加入淀粉酶）液化压滤糖化（加入糖化酶）升温压滤精制浓缩 a. 液体糖浆 b. 葡萄糖异构酶异构化精制浓缩果葡糖浆 c. 结晶离心分离干燥结晶葡萄糖,二、 -淀粉酶 （一）基体性能 外淀粉酶，作用于多糖的非还原端-1，4糖苷键，产物为麦芽糖（主要产物）和糊精,四、脱支酶（R酶） 脱支酶是水解支链淀粉、糖原等大分子化合物中一1，6糖苷键的酶，脱支酶可分为直接脱支酶和间接脱支酶两大类，前者可水解未经改性的支链淀粉或糖原中的一1，6糖苷键，后者仅可作用于经酶改性的支链淀粉或糖原，这里仅讨论直接脱支酶。,根据水解底物专一性的不同，直接脱支酶可分为异淀粉酶和普鲁蓝酶两种。异淀粉酶只能水解支链结构中的一1，6糖苷键，不能水解直链结构中的l，6糖苷键；普鲁蓝酶不仅能水解支链结构中的a一1，6糖苷键，也能水解直链结构中的-1，6糖苷键，因此它能水解含一1，6糖苷键的葡萄糖聚合物。 脱支酶在淀粉制糖工业上的主要应用是和一淀粉酶或葡萄糖淀粉酶协同糖化，提高淀粉转化率，提高麦芽糖或葡萄糖得率。,淀粉的酶液化和酶糖化工艺,（一）酶液化 1 液化机理 液化使用一淀粉酶，它能水解淀粉和其水解产物分子中的一1，4糖苷键，使分子断裂，黏度降低。一淀粉酶属于内酶，水解从分子内部进行，不能水解支链淀粉的一1，6葡萄糖苷键，当一淀粉酶水解淀粉切断一1，4键时，淀粉分子支叉地位的一1，6键仍然留在水解产物中，得到异麦芽糖和含有一1，6键、聚合度为34的低聚糖和糊精。但一淀粉酶能越过一1，6键继续水解一1，4键，不过一1，6键的存在，对于水解速度有降低的影响，所以一淀粉酶水解支链淀粉的速度较直链淀粉慢。 国内常用的一淀粉酶有由芽孢杆菌BF一7658产的液化型淀粉酶和由枯草杆菌产生的细菌糖化型一淀粉酶以及由霉菌产生的一淀粉酶。因其来源不同，各种酶的性能和对淀粉的水解效能亦各有差异。,酶液化和酶糖化的工艺称为双酶法或全酶法,淀粉糖的制造工艺,一、,2、 液化方法,液化方法有3种：升温液化法、高温液化法和喷射液化法。 1 ） 升温液化法 这是一种最简单的液化方法。3040的淀粉乳调节pH值为6065，加入CaCl2调节钙离子浓度到O01 molL，加入需要量的液化酶，在保持剧烈搅拌的情况下，喷入蒸汽加热到8590，在此温度保持3060 min达到需要的液化程度，加热至100以终止酶反应，冷却至糖化温度。此法需要的设备和操作都简单，但因在升温糊化过程中，黏度增加使搅拌不均匀，料液受热不均匀，致使液化不完全，液化效果差，并形成难于受酶作用的不溶性淀粉粒，引起糖化后糖化液的过滤困难，过滤性质差。为改进这种缺点，液化完后加热煮沸10 min，谷类淀粉(如玉米)液化较困难，应加热到140，保持几分钟。虽然如此加热处理能改进过滤性质，但仍不及其他方法好。,2 ） 高温液化法,将淀粉乳调节好pH值和钙离子浓度，加入需要量的液化酶，用泵打经喷淋头引入液化桶中约90的热水中，淀粉受热糊化、液化，由桶的底部流出，进入保温桶中，于90保温约40 min或更长的时间达到所需的液化程度。此法的设备和操作都比较简单，效果也不差。缺点是淀粉不是同时受热，液化欠均匀，酶的利用也不完全，后加入的部分作用时间较短。对于液化较困难的谷类淀粉(如玉米)，液化后需要加热处理以凝结蛋白质类物质，改进过滤性质。在130加热液化510 min或在150加热115 min。,3 ） 喷射液化法,先通蒸气人喷射器预热到8090，用位移泵将淀粉乳打入，蒸气喷入淀粉乳的薄层，引起糊化、液化。蒸气喷射产生的湍流使淀粉受热快而均匀，黏度降低也快。液化的淀粉乳由喷射器下方卸出，引入保温桶中在8590保温约40 min，达到需要的液化程度。此法的优点是液化效果好，蛋白质类杂质的凝结好，糖化液的过滤性质好，设备少，也适于连续操作。马铃薯淀粉液化容易，可用40浓度；玉米淀粉液化较困难，以2733浓度为宜，若浓度在33 %以上，则需要提高用酶量两倍。,（二）、糖化,在液化工序中，淀粉经一淀粉酶水解成糊精和低聚糖范围的较小分子产物，糖化是利用葡萄糖淀粉酶进一步将这些产物水解成葡萄糖。纯淀粉通过完全水解，会增重，每100份淀粉完全水解能生成lll份葡萄糖，但现在工业生产技术还没有达到这种水平。双酶法工艺的现在水平，每100份纯淀粉只能生成105108份葡萄糖，这是因为有水解不完全的剩余物和复合产物如低聚糖和糊精等存在。如果在糖化时采取多酶协同作用的方法，例如除葡萄糖淀粉酶以外，再加上异淀粉酶或普鲁蓝酶并用，能使淀粉水解率提高，且所得糖化液中葡萄糖的百分率可达99以上。,双酶法生产葡萄糖工艺的现在水平，糖化2 d葡萄糖值达到9598。在糖化的初阶段，速度快，第一天葡萄糖达到90以上，以后的糖化速度变慢。葡萄糖淀粉酶对于一1，6糖苷键的水解速度慢。提高用酶量能加快糖化速度，但考虑到生产成本和复合反应，不能增加过多。降低浓度能提高糖化程度，但考虑到蒸发费用，浓度也不能降低过多，一般采用浓度约30。,1 糖化机理 糖化是利用葡萄糖淀粉酶从淀粉、糊精、麦芽糖和低聚糖等的非还原性尾端开始水解一1，4葡萄糖苷键，使葡萄糖单位逐个分离出来，从而产生葡萄糖。,2 糖化操作,糖化操作比较简单，将淀粉液化液引入糖化桶中，调节到适当的温度和pH值，混入需要量的糖化酶制剂，保持23 d达到最高的葡萄糖值，即得糖化液。糖化桶具有夹层，用来通冷水或热水调节和保持温度，并具有搅拌器，保持适当的搅拌，避免发生局部温度不均匀现象。,糖化的温度和pH值决定于所用糖化酶制剂的性质。曲霉一般用60，pH值4O45，根霉用55，pH值5O。根据酶的性质选用较高的温度，可使糖化速度较快，感染杂菌的危险较小。选用较低的pH值，可使糖化液的色泽浅，易于脱色。加入糖化酶之前要注意先将温度和pH值调节好，避免酶与不适当的温度和pH值接触，活力受影响。在糖化反应过程中，pH值稍有降低，可以调节pH值，也可将开始的pH值稍高一些。,达到最高的葡萄糖值以后，应当停止反应，否则，葡萄糖值趋向降低，这是因为葡萄糖发生复合反应，一部分葡萄糖又重新结合生成异麦芽糖等复合糖类。这种反应在较高的酶浓度和底物浓度的情况下更为显著。葡萄糖淀粉酶对于葡萄糖的复合反应具有催化作用。 糖化液在80，受热20 min，酶活力全部消失。实际上不必单独加热，脱色过 程中即达到这种目的。活性炭脱色一般是在80保持30 min，酶活力同时消失。,二、精制和浓缩,淀粉糖化液的糖分组成因糖化程度而不同，如葡萄糖、低聚糖和糊精等，另外还有糖的复合和分解反应产物、原存在于原料淀粉中的各种杂质、水带来的杂质以及作为催化剂的酸或酶等，成分是很复杂的。这些杂质对于糖浆的质量和结晶、葡萄糖的产率和质量都有不利的影响，需要对糖化液进行精制，以尽可能地除去这些杂质。,（一）过滤 过滤就是除去糖化液中的不溶性杂质，目前普遍使用板框过滤机，同时最好用硅藻土为助滤剂，来提高过滤速度，延长过滤周期，提高滤液澄清度。一般采用预涂层的办法，以保护滤布的毛细孔不被一些细小的胶体粒子堵塞。 为了提高过滤速率，糖液过滤时，要保持一定的温度，使其黏度下降，同时要正确地掌握过滤压力。因为滤饼具有可压缩性，其过滤速度与过滤压力差密切相关。但当超过一定的压力差后，继续增加压力，滤速也不会增加，反而会使滤布表面形成一层紧密的滤饼层，使过滤速度迅速下降。所以过滤压力应缓慢加大为好。不同的物料，使用不同的过滤机，其最适压力要通过试验确定。,（二）、脱色 糖液中含有的有色物质和一些杂质必须除去，才能得到澄清透明的糖浆产品。工业上一般采用骨炭和活性炭脱色。活性炭又分颗粒和粉末炭2种。骨炭和颗粒炭可以再生重复使用，但因设备复杂，仅在大型工厂使用。一般中小型工厂使用粉末活性炭，重复使用2或3次后弃掉，成本高，但设备简单，操作方便。 1 脱色工艺条件 1）糖液的温度 活性炭的表面吸附力与温度成反比，但温度高，吸附速率快。在较高温度下，糖液黏度较低，加速糖液渗透到活性炭的吸附内表面，对吸附有利。但温度不能太高，以免引起糖的分解而着色，一般以80为宜。,2） pH值 糖液pH值对活性炭吸附没有直接关系，但一般在较低pH值下进行，脱色效率较高，葡萄糖也稳定。工业上均以中和操作的pH值作为脱色的pH值。 3） 脱色时间 一般认为吸附是瞬间完成的，为了使糖液与活性炭充分混合均匀，脱色时间以2530 min为好。 4） 活性炭用量 活性炭用量少，利用率高，但最终脱色差；用量大，可缩短脱色时间，但单位质量的活性炭脱色效率降低。因此要恰当掌握，一般采取分次脱色的办法，并且前脱色用废炭，后脱色用好炭，以充分发挥脱色效率。 2 脱色设备 糖液脱色是在具有防腐材料制成的脱色罐内完成的。罐内设有搅拌器和保温管，罐顶部有排汽筒。脱色后的糖液经过滤得到无色透明的液体。,（三）、离子交换树脂处理 糖液经活性炭处理后，仍有部分无机盐和有机杂质存在，工业上采用离子交换树脂处理糖液，起到离子交换和吸附的作用。离子交换树脂除去蛋白质、氨基酸、羟甲基糠醛和有色物质等的能力比活性炭强。经离子交换树脂处理的糖液，灰分可降低到原来的110，对有色物质去除彻底，因而，不但产品澄清度好，而且久置也不变色，有利于产品的保存。 离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两种，目前普遍应用的工艺为阳一阴一阳一阴4只滤床，即2对阳、阴离子交换树脂滤床串联使用。,（四）浓缩 经过净化精制的糖液，浓度比较低，不便于运输和储存，必须将其中大部分水分去掉，即采用蒸发使糖液浓缩，达到要求的浓度。 淀粉糖浆为热敏性物料，受热易着色，所以在真空状态下进行蒸发，以降低液体的沸点。一般蒸发温度不宜超过68。蒸发操作有间歇式、连续式和循环式3种。,采用间歇式蒸发，糖液受热时间长，不利于糖浆的浓缩，但设备简单，最终浓度容易控制，有的小型工厂还在采用。 采用连续式蒸发，糖液受热时间短，适应于糖液浓缩，处理量大，设备利用率高，但最终浓度控制不易，在浓缩比很大时难于一次蒸发达到要求。 采用循环式蒸发可使一部分浓缩液返回蒸发器，物料受热时间比间歇式短，浓度也较易控制，适合糖液的浓缩。蒸发操作中的主要费用是蒸汽消耗量，为了节约蒸汽，可采用多效蒸发，充分利用二次蒸汽，又节约大量的冷却用水。,第一节 碳水化合物酶（二） 一、纤维素酶,（一）纤维素酶的组成及作用机理 内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶或纤维二糖酶（CBH）、 -葡萄糖苷酶（BG）。,图2 EG，CBH和BG协同作用降解纤维素,纤维素酶按其催化反应的最适pH值，可分为酸性纤维素酶(最适pH值为35)、中性纤维素酶(最适pH值为68)和碱性纤维素酶(最适pH值为811)。酸性纤维素酶酶系最全、开发最早，目前应用广泛。中性和碱性纤维素酶通常只有内切-葡聚糖酶活力,（二）菌种筛选 1、 羧甲基纤维素钠培养基（CMC培养基） NaCl 6 g，MgSO47H2O 0.1 g， KH2PO4 0.5 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 2.0 g， CMC-Na 15 g， CO(NH2)2 2.0 g，蒸馏水 1000mL， pH 7.0-7.4 ；固体培养基加1.5%琼脂,2、固体培养初筛 将采集到的腐烂的含菌的样品放在三角瓶中，加入50 mL左右的无菌水，充分搅拌后静置，用三层灭菌的纱布过滤，再静置，吸取上清液以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等梯度稀释,将稀释液涂布在选择培养基羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板上，28 恒温培养2 d，从培养基上挑取单菌落于CMC平板上划线分离纯化,获得到的菌株分别转接于CMC平板上，28 再培养2 d，用刚果红染色10 min后，再用NaCl脱色5 min，能分解纤维素的菌株周围会出现清晰的透明圈，选择出透明圈直径与菌落直径比值大的菌株作为下一步研究的对象。,细菌、真菌的分离 将筛选获得的产纤维素酶的菌株接种到马丁培养基中，28 培养2 d，能在该培养基中生长良好的为真菌。 马丁培养基：葡萄糖1 g，蛋白胨0.5 g ，KH2PO43H2O 0.1 g ，MgSO47H2O 0.05 g，0.1孟加拉红溶液 0.33 mL，琼脂 1.5 g ，蒸馏水100 mL，自然pH，2去氧胆酸钠溶液2 mL（预先灭菌，临用前加入），链霉素溶液（10000u/mL） 0.33 mL（临用前加入）,2、摇瓶发酵复筛 将固体培养复筛所得的菌株进行摇瓶发酵，测定纤维素酶活, 用3 ,5-二硝基水杨酸法(DNS 法)测定还原糖，通过还原糖量的多少代表纤维素内切酶活力的高低, 反映菌株纤维素总酶活的强弱，选择酶活高的菌株,（三）纤维素酶的发酵生产 1、固体发酵 2、液体深层发酵 三、用途,二、果胶酶： 果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶,果胶酶水解果胶主要生成-半乳糖醛 酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力。 果胶酶主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。 作用PH：2.5-6.0，最适作用PH3.5。 作用温度为15-55左右。最适作用温度为 50。 应用范围： 果浆用酶： 果汁用酶：,溶菌酶 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐