基因遗传多态性在药物动力学研究中的意义.ppt

2019/4/26,1,基因遗传多态性在药物动力学 研究中的意义,李 金 恒 南京军区总医院临床药理科 南京 210002,2019/4/26,2,随着医学生物技术的发展日新月异，新的药物层出不穷，但人类在与疾病作斗争的过程中仍然面临着许多重大难题，如药物疗效个体差异大，总有效率捉摸不定；或药物的不良反应严重，导致巨大的精神和经济损失。,临床用药中常可见到同种疾病的患者对相同的药物可以产生不同的反应。有人表现出高度敏感性，或容易产生不良反应；有的却表现为耐受性，即为药物反应的个体差异。,2019/4/26,3,生命演化过程中基因的趋异进化和遗传多态性增加了临床用药的复杂性。,1. 小分子药物在体内作用的靶分子不可能具有绝对专一性，如G蛋白偶联受体超家族约有2 000个，很难避免它们与某种药物不发生交叉作用。 2. 不同个体内所含结合药物的转运蛋白、药物代谢酶存在着差异，使机体对药物的处置有所不同。,2019/4/26,4,药物体内过程的个体差异,虽然引起药物反应个体差异的原因很多，但遗传因素起相当重要的作用。 Science：药物代谢酶、转运药物的蛋白质、受体和其它药物靶体的遗传多态性与药物效应和毒性的个体差异密切相关。 药物的体内过程：吸收、分布、代谢、排泄 * 遗传多态性与药物分布 * 遗传多态性与药物代谢,2019/4/26,5,第一部分,与药物分布有关的遗传多态性,2019/4/26,6,遗传多态性与药物分布,药物-血浆蛋白结合 弱酸：白蛋白 弱碱：类粘蛋白(ORM，1-AGP) 药物的血浆蛋白结合率-个体差异 原因：不明确 后果：药效，ADRs,2019/4/26,7,类粘蛋白(orosomucoid,ORM),ORM(1-AGP)：急性反应相蛋白 合 成：肝脏 分子量：4041 kD 含 量：0.51.2 g/L 一级结构： 183个氨基酸 2个二硫键(第5位、147位) 5条糖侧链(第15、38、54、75、86位) -末端为唾液酸,2019/4/26,8,ORM遗传多态性,ORM基因定位： 9q3134.1(外显子6，内含子5) ORM受控于两个基因座： ORM1、ORM2（共显性复等位基因） ORM1座位：高度多态 常见等位基因：ORM1*F1, ORM1*F2, ORM1*S ORM2座位：单态 “一个基因一个多态链” 个体的遗传性质可表现在蛋白质的结构、数量、构型上 ORM1的基因遗传多态性决定了编码合成的各种表型的ORM1蛋白质具有不同的结构和功能。,2019/4/26,9,研究目的,中国汉族人群ORM1遗传多态性的分布、ORM1表型、基因频率； 不同ORM1表型对弱碱性药物奎尼丁、阿米替林血浆蛋白结合率和游离药物的影响；,2019/4/26,10,中国南京地区汉族人 ORM遗传多态性,2019/4/26,11,样 品 南京地区220名无血缘关系的健康男性受试者 采血后2小时内分离血清，-20OC保存备用 ORM表现型参考血清由Thymann M博士提供,血清ORM表型分型 去唾液酸血清ORM等电聚焦电泳、免疫印迹方法 按Thymann等命名法判定ORM表型，并计算ORM基因频率 数据处理：用2检验对有关数据进行统计分析,2019/4/26,12,结 果,2019/4/26,13,ORM1座位 检出了由ORM1F1、ORM1F2和ORM1S 3个复等位基因控制的5种表现型：F1，S，F1F2，F1S、F2S； 纯合子F1、S：分别为近阳极侧或近阴极侧的一组蛋白带； 杂合子F1S，F1F2、F2S：相应具有F1、F2、S蛋白带特征；,ORM2座位 全部检出了由ORM2A基因控制的ORM2 A型，其较为浅色的蛋白带位于ORM1 S带的近阴极侧。,2019/4/26,14,ORM1 F1,ORM1 F2,1 2 3 4 5 6 7 8 9,ORM1 S,ORM2 A,等电聚焦电泳-免疫印迹图 Lane 1: ORM1 F1 F2 Lanes 2, 6: ORM1 F1 Lanes 3, 9: ORM1 S Lanes 4, 5, 7: ORM1 F1S Lane 8: ORM1 F2S,2019/4/26,15,ORM1表型-基因频率,ORM1座位： F1： 47.27% S： 5.46% F1F2：3.18% F1S： 43.64% F2S： 0.45% ORM1基因频率： ORM1F1：0.7068 ORM1F2：0.0182 ORM1S ： 0.2750,2019/4/26,16,表1 中国南京地区汉族人ORM1表型及基因频率,表 型 观察值 期望值 基 因 频 率 (n) (n) ORM1 F1 104 109.91 ORM1F1=0.7068 ORM1 F2 0 0.07 ORM1F2=0.0182 ORM1 S 12 16.64 ORM1S =0.2750 ORM1 F1F2 7 5.66 2 = 1.5074 ORM1 F1S 96 85.52 df = 3 ORM1 F2S 1 2.20 P 0.05 Total 220 220.00,2019/4/26,17,ORM1遗传表型,理论上：ORM1座位的3个复等位基因控制着ORM1的6种表现型 本文结果：5种ORM1表型，即F1，S，F1F2，F1S和F2S，未发现 ORM1 F2纯合子 文献结果：印度和东南亚地区的人群中极少有检出纯合子 F2的报道,2019/4/26,18,不同人群ORM1基因频率的比较 ORM1座位的基因频率与人群所在的地理位置(经度)有显著关系地理倾群 (geographical cline) ORM1*F1：西东 逐渐上升 (r=0.80, P0.01) ORM1*S：西东 逐渐降低 (r=0.84, P0.01),ORM1*F1 ORM1*S 欧洲人 0.60 0.40 亚洲人 0.690.81 0.200.30,2019/4/26,19,研究之二,ORM1表型对弱碱性药物游离 浓度和蛋白结合率的影响,2019/4/26,20,ORM1表型与蛋白结合率,奎尼丁、阿米替林：常用弱碱性药物 安全范围窄，药动学药效学个体差异大，临床上常需监测血药浓度； 在体内转运的重要特征：蛋白结合率显著的个体差异，确切原因不明； 药物血浆蛋白结合率高低，决定了药物作用的强度和持续时间(游离型药物被转运、生物转化、排泄)； ORM是弱碱性药物的主要结合蛋白质，又因ORM1具遗传多态性而ORM2 为单态，设想：不同ORM1表型蛋白质结构的不同，将引起其与药物结合功能的差异； 研究目的：不同ORM1表型对弱碱性药物奎尼丁阿米替林的游离浓度和血浆蛋白结合率的影响。,2019/4/26,21,ORM1表型与蛋白结合率,28名健康男性志愿者，年龄21.31.3岁，体重62.37.5 kg，身高 171.56.7 cm； 所有受试者经体检证实为健康，临床实验室检查项目如血清谷-丙酶、谷-草酶、球蛋白、尿素氮、肌酐等均在正常范围。 试验前每位受试者签署知情同意书； 血清ORM1表型： 纯合子： ORM1 F1 10人 ORM1 S 8人 杂合子： ORM1 F1S 10人 随机、交叉试验；空腹、单剂量口服硫酸奎尼丁片200mg或盐酸阿米替林片50 mg；给药后不同时间取血。,2019/4/26,22,ORM1表型与蛋白结合率,药物总浓度测定：HPLC 药物游离浓度测定：超滤离心/HPLC * 血浆超滤：已建立的微超滤离心法 取血浆400 l置于微型超滤管(Ultrafree-MC，PLTK膜，截留分子量30 kDa，Millipore，USA)，离心(2 000 g，20 min)； * 超滤液：测定奎尼丁、阿米替林游离浓度； 血浆蛋白结合率(%) = (总浓度-游离浓度)/总浓度)100%,2019/4/26,23,ORM1表型与蛋白结合率,结 果,2019/4/26,24,表 健康受试者血清ORM和白蛋白浓度.xs.,ORM1 n ORM* Albumin* 表 型 (mgL-1) (gL-1) F1 10 573.2 29.3 57.5 3.0 S 8 553.8 31.2 57.6 1.5 F1S 10 569.8 40.1 58.4 1.5 ORM1 F1, S和 F1S三组表型间比较，* P0.05.,2019/4/26,25,Fig. Serum total quinidine concentration-time curve after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy subjects with the three ORM1 phenotypes. xs. : ORM1 F1(n=10)，: ORM1 S(n=8)，: ORM1 F1S(n=10),2019/4/26,26,Fig. Unbound quinidine serum concentration-curve after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy subjects with the three ORM1 phenotypes. xs. : ORM1 F1(n=10)，: ORM1 S(n=8)，: ORM1 F1S(n=10),2019/4/26,27,Fig. Percentage for unbound serum quinidine after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy subjects with the three ORM1 phenotypes. xs. : ORM1 F1(n=10)， : ORM1 S(n=8)， : ORM1 F1S(n=10) * P0.01 vs ORM1 F1 phenotype.,*,*,2019/4/26,28,Tab. Pharmacokinetics parameters of total quinidine after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy male subjects with the three ORM1 phenotypes.xs.,ORM1 n ke l Cmax tmax t1/2 Cl/F Vd AUC Phenotypes h-1 gL-1 h h Lh-1 Lkg1 ghL-1 F1 10 0.124 1015.5 2.2 5.65 23.60 3.09 8845.3 0.012 220.5 0.3 0.55 5.16 0.57 1916.2 S 8 0.113 1055.9 1.8 6.22 23.06 3.45 8857.2 0.015 232.5 0.5 0.90 3.96 0.61 1257.3 F1S 10 0.120 988.6 1.9 6.06 24.62 3.23 8543.6 0.029 145.7 0.4 1.39 5.68 0.58 2047.9,2019/4/26,29,Tab. Protein binding percentage(%) of serum quinidine after a single oral dose of 200 mg quinidine sulfate in the healthy male subjects with the three ORM1 phenotypes.xs.,ORM1 n Time after dosing (h) Phenotypes 8 12 24 F1 10 93.64 2.98 91.88 4.11 80.21 6.13 S 8 94.38 0.89 93.18 1.82 89.31 4.83* F1S 10 94.38 1.27 92.26 2.57 87.26 3.42* * P 0.01 vs ORM1 F1 phenotype,2019/4/26,30,血浆阿米替林总浓度,健康受试者单剂量口服阿米替林50 mg后，各ORM1表型组阿米替林总浓度的药-时过程和血药浓度相似； ORM1表型 Cmax (gL-1) Tmax(h) F1 (n=10) 40.3110.25 3.90.6 S (n=10) 34.55 7.56 3.90.8 F1S (n=10) 38.79 9.08 4.10.6 此后血药浓度逐渐下降，给药后36h血清阿米替林总浓度在4.545.06 gL-1。,2019/4/26,31,表 单剂量口服盐酸阿米替林片50mg后的血浆阿米替林总浓度(gL-1).xs.,ORM1 Time (h) 表 型 1 2 3 4 5 6 8 10 12 24 36 F1 10.32 26.30 35.73 39.70 35.62 31.58 27.17 20.79 14.45 9.42 5.06 (n=10) 4.80 5.36 8.65 10.21 10.24 8.77 7.84 7.45 6.03 4.13 2.76 S 8.51 19.96 25.06 32.54 29.28 24.30 19.55 15.96 11.56 7.01 4.54 (n=8) 5.17 6.41 7.13 8.41 4.40 3.93 3.10 3.91 2.11 1.37 0.98 F1S 10.25 24.98 31.44 37.42 34.11 27.45 24.67 18.86 13.44 8.83 4.99 (n=10) 5.56 6.29 8.25 9.88 8.81 7.19 6.61 6.57 3.54 3.61 2.10,2019/4/26,32,血浆阿米替林游离浓度,尽管3种ORM1表型者阿米替林游离浓度的药-时过程相似，但其水平高低却有一定差别； 给药后8h，12h和24h，纯合子ORM1 F1表型组的平均游离阿米替林浓度明显高于纯合子ORM1 S表型组，而杂合子ORM1 F1S 表型组则介于上述两者之间。,2019/4/26,33,表 单剂量口服盐酸阿米替林片50mg后的 血浆游离阿米替林浓度(gL-1).xs.,ORM1 n 给药后时间 (h) 表 型 8 12 24 F1 10 2.580.55 2.290.57 1.750.54 S 8 1.640.30* 1.290.19* 0.910.12* F1S 10 2.250.71* 1.800.43* 1.370.44* 与ORM1 F1表型组比较，* P 0.05, * P 0.01.,2019/4/26,34,阿米替林药动学参数,口服给药后，用开放性二室模型拟合阿米替林总浓度的药物动力学参数。 反映药物吸收总量的AUC等和反映药物分布、消除的Vd、t1/2等参数在不同ORM1表型组间略有差别，但无显著性(P0.05)。,2019/4/26,35,表 单剂量口服盐酸阿米替林片50mg后血浆阿米替林总浓度 的药物动力学参数.xs.,ORM1 n Tmax Cmax Cl/F Vd t1/2 t1/2 AUC036 AUC0 表 型 h gL-1 Lh-1 L kg1 h h ghL-1 ghL-1 F1 10 3.9 40.31 86.83 14.88 2.45 21.22 535.5 639.9 0.6 10.25 29.97 5.45 0.80 7.41 175.2 220.1 S 8 3.9 34.55 92.91 17.26 2.52 22.97 424.8 544.0 0.8 7.56 17.69 5.16 0.69 5.30 67.4 120.1 F1S 10 4.1 38.79 86.00 13.97 2.48 23.37 496.8 612.2 0.6 9.08 29.17 3.98 0.97 8.61 132.3 182.2,2019/4/26,36,阿米替林血浆蛋白结合率(%),ORM1 S表型： ORM1 F1表型 ORM1 F1S表型：介于上述两者之间 ORM1 n 给药后时间(h) 表 型 8 12 24 F1 10 90.052.42 82.774.05 79.994.39 S 8 91.35 2.24* 88.582.22* 86.762.08* F1S 10 90.71 2.36* 85.983.95* 83.434.65* 与ORM1 F1表型组比较，* P 0.05, * P 0.01.,2019/4/26,遗传表型-蛋白结合率,ORM和白蛋白是药物在血浆中的二种主要的结合蛋白质，其浓度水平可影响蛋白结合率。各组受试者的血浆药物结合蛋白质含量的一致对于维持本实验条件的均衡性有重要意义。 作为观察不同ORM1表型对弱碱性药物(奎尼丁、阿米替林等)蛋白结合率影响的控制因素，本研究中三组ORM1表型受试者的血清ORM和白蛋白浓度均较为接近，组间无显著性差异。,2019/4/26,38,遗传表型-蛋白结合率,研究发现，给药后24 h即药物的体内分布达完全平衡时，ORM1 F1表型者的游离药物浓度显著高于ORM1 S表型者。但t1/2及其它药动学参数等不受ORM1表型的影响； 结果表明，ORM1表型的多态性主要影响弱碱性药物的分布(转运)，而对肝代谢和消除的影响不大； 提示：ORM1遗传变异引起其功能上的差别能够解释药物血浆蛋白结合率的个体间差异。,2019/4/26,39,遗传表型-蛋白结合率,阿米替林、美沙酮等体外蛋白结合率实验：ORM1 S 蛋白与各种弱碱性药物的亲和力比ORM1 F蛋白高：ORM1 S蛋白的结合位点数为0.560.06，而ORM1 F蛋白仅为0.170.09。所以后者表现为较低的蛋白结合率、较高的游离药物水平，而前者则反之。 由此可见，各种ORM1表型个体表现出不同的药物血浆蛋白结合率。可以预料，对于ORM1 F1表型个体，过高的游离药物浓度将引起过强的药理效应；,2019/4/26,40,遗传表型-蛋白结合率,不同ORM1遗传表型明显影响弱碱性药物奎尼丁、阿米替林的游离浓度和蛋白结合率；ORM1 F1表型者药物的血浆蛋白结合率最低，而游离药物浓度最高。 奎尼丁、阿米替林等血浆药物总浓度测定结果可能引起误导； 对于弱碱性、蛋白结合率较高的治疗药物，不同的个体血中游离药物浓度有显著差别；依靠总浓度获得的药代动力学参数对临床用药的指导意义受到限制。,2019/4/26,41,第二部分,与药物代谢有关的遗传多态性,2019/4/26,42,遗传多态性与药物代谢,大多数药物由肝脏的药酶代谢，以利于通过肾脏或胆汁排泄。 肝药酶的遗传多态性具有临床意义的有三大类： 氧化代谢酶：CYP2D6、CYP2C19，等 S-甲基转移酶 N-乙酰转移酶(NAT),2019/4/26,43,人类N-乙酰化酶,人类的N-乙酰化反应：由NAT1、NAT2所介导。 NAT1：涉及少数药物的代谢(对氨水扬酸，氨苯甲酸，磺胺甲基异恶唑等) 一般认为：单态分布，近年提示有多态性 NAT2：许多药物的代谢酶，如肼类药物(异烟肼，肼苯达嗪)，芳基胺类药物(氨苯砜，普鲁卡因胺，醋丁洛尔，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶)，咖啡因，安乃近等。 具有遗传多态性,2019/4/26,44,人类N-乙酰化酶,控制人NAT2的基因：第8号染色体 若NAT2基因的外显子密码发生不同形式的点突变 M1型(NAT2*5A) ：T341C M2型(NAT2*6A) ：G590A M3型(NAT2*7A) ：G857A 肝内NAT2含量不足，相关药物的乙酰化速率减慢， 相应个体为慢乙酰化表型 野生型基因NAT2*4纯合子：快乙酰化表型 野生型基因杂合子：中间乙酰化表型,2019/4/26,45,人类N-乙酰化酶,药物乙酰化能力在人群中表现出遗传多态性 快、慢乙酰化的发生率有明显的种族差异 慢乙酰化的发生率(%) 埃及、中东人 8090 欧洲、北美高加索人 4070 亚洲人 1020,2019/4/26,46,慢乙酰化个体的临床意义,慢乙酰化者易产生药物不良反应 结核病的流行有重新加剧之势 WHO：全球感染者近20亿人，结核病人2000万，每年病死亡200万，是世界上单一致病菌死亡率最高的疾病。 中国是全球22个结核病高负担国家之一，仅次于印度，居世界第二。全国感染人数超过4亿，结核病人200万。 常规剂量的异烟肼，易发生外周神经炎等不良反应；普鲁卡因胺：易发生红斑狼疮样综合征。 慢乙酰化者易产生药物不良反应 有人认为慢乙酰化者易发生直肠癌或膀胱癌 识别慢乙酰化个体具有重要的临床意义,2019/4/26,47,慢乙酰化的意义,来自动物实验结果的启示： Beagle犬的氧化代谢酶遗传多态性对COX-2抑制剂celecoxib药代动力学的影响。 PM and EM phenotypes within a population of beagle dogs(n=242) 强代谢(EM)表型 弱代谢(PM)表型 无法定型 45.0% 53.5% 1.65%,2019/4/26,48,TAB. Pharmacokinetic parameters (mean s) of Celecoxib in i.v.-dosed male and female dogs,Populationa Sex/n T1/2 Cl Vd AUC0- h ml/min/kg L/kg g/ml*h Male/11 1.770.9 19.27.7 2.631.37 4.951.80 EM Female/8 1.660.43 16.94.2 2.320.41 5.201.23 M and F/19 1.720.79 18.26.4 2.501.07 5.051.55 Male/8 4.691.25 7.431.23 2.950.60 11.52.0 PM Female/11 5.541.24 6.951.55 3.270.72 12.52.6 M and F/19 5.181.29 7.151.41 3.130.67 12.12.33 a Celecoxib T1/2, Cl, and AUC0- were statistically different between EM and PM dogs (p0.001). Celecoxib Vd were statistically different between EM and PM dogs (p0.01). From Paulson et al. Drug Metab Dispos 1999; 27(10): 1133-42,2019/4/26,49,慢乙酰化的意义,EM、PM犬给药后的血浆半衰期分别为1.72h、5.18h，差异极为显著; 其它药动学参数在两种不同表型犬之间也有明显差异。 可见区别不同代谢速率的实验对象，是准确描述药代动力学过程的基础。,2019/4/26,50,慢乙酰化的意义,慢乙酰化者影响新药制剂的生物利用度、生物等效性评价结果 评价新药制剂的生物等效性：健康受试者1824例 由于有限数量的受试者存在着快、慢乙酰化个体，使得服用经由乙酰化代谢药物的血浓度及药动学参数存在极大的个体差异； 另外相同药物不同批次(不同试验单位)的研究中，受试对象的快、慢乙酰化个体数不同，获得的血药浓度、参数缺乏可比性； 严重影响了新药生物利用度试验结果及生物等效性的评价 有必要分别进行快、慢乙酰化个体健康受试者的生物利用度试验。此时获得的有关药动学试验数据，对临床用药更具指导意义。,2019/4/26,51,Tab Plasma concentration and CAcINH/CINH ratio in various NAT2 genotypes,2019/4/26,52,Fig Distribution of the AcINH/INH ratio in three NAT2 genotypes in 46 Chinese pulmonary tuberculosis patients,2019/4/26,53,慢乙酰化的意义,由国外引进的相关药物所提供的药动学参数不完全适合中国人 前已述及，白种人与中国人快、慢乙酰化表型有明显的群体差异。可以肯定，相关药物在白种人获得的药动学参数、剂量等不完全适合于中国人。 综上所述，我们认为人体药代动力学研究和制剂的生物等效性评价，必须首先基于对受试对象的相关药物代谢酶遗传多态性的认识。,2019/4/26,54,慢乙酰化的意义,表 不同国家生物等效性研究指南比较 欧 盟 日 本 基因多态性 排除慢代谢者 排除慢代谢者 为此，应开发某种快速的、多用途的、实用性的产品，以适应新药药代动力学和生物等效性研究的