饲用酶制剂的酶活检测方法及评定.doc

饲用酶制剂的酶活检测方法及评定随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。1 酶制剂的定义及分类所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。工业上应用的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。按动物体内是否分泌，分为消化酶和非消化酶两大类。消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。2 常见的酶活测定方法通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。其操作相对简单，检测所用时间短，便于生产实践应用。酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶（GB/T 18634）、纤维素酶（NY/T912）、葡聚糖酶（NY/T 911）的测定方法。另外，许多企事业单位为了生产研究的需要也制定了很多用于各种酶制剂活力的测定方法。目前测定酶制剂活性的方法主要有：2.1 比色法比色法是以反应生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法，根据原理不同可分为还原糖法和色原底物法。2.1.1 还原糖法。这种方法是通过酶作用于化学合成或从自然界提取出来的底物来进行测定的。非淀粉多糖酶与底物在特定的条件（温度、pH值和底物浓度）下反应，反应产物为还原糖，在与显色剂反应后，通过比色确定还原糖的生成量，同时制作标准曲线。酶的活性表示为单位时间产生一定浓度的产物所需要的酶量（mg 或 mL）。该法可适用于大部分酶活力的测定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、- 葡聚糖酶、纤维素酶等的测定。根据显色剂的不同又可分为DNS 法、钒钼酸铵法和地衣酚法。其中 DNS 法由于操作简单、显色稳定，是目前众多实验室和饲料企业在测定非淀粉多糖酶时应用最多的测定方法。2.1.2 色原底物法。原理是利用人工合成的含色原基团的底物在酶的作用下释放出有色物质，利用分光光度计比色测定有色物质的含量计算酶活。如木聚糖酶活力的测定。该法操作简单、重现性好，但酶作用于合成底物与天然底物的效果有一定区别，用合成底物测定的酶活并不能代表酶制剂在应用于天然饲料时所能发挥的酶活大小。2.2 黏度法这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物（控制 pH 值、温度等条件）的黏度的能力来确定酶的活性。利用的底物主要有化学合成的底物（如 CMC 用于纤维素酶的测定） 和自然提取的底物（如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定）。测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较，来确定酶的活性。该法可用于木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶等酶活测定。这种方法的特点是通过降低底物的粘度来反映酶的活性，这也正是酶在体内起作用的重要特征。该法虽然灵敏度较高，但重现性差，操作复杂费时，应用难于普及。2.3 免疫学法用于酶活性分析的免疫学法包括 ELISA 法和免疫凝胶扩散法。这两种方法是根据酶与抗体之间发生反应，然后 ELISA 法通过第二步反应，凝胶扩散法则通过印染过程来确定酶的活性。这些方法非常灵敏，能够检测到极低水平的酶蛋白。但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体，另外抗体能够与非酶蛋白质发生反应。由于抗体本身所用的蛋白质是特定的，因此，由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。另外，采用实验动物的敏感性也值得探讨。2.4 凝胶扩散法这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中，凝固之后，在凝胶上切开一条凿，倒入标准酶液和测试酶液。培养一定时间后，在切开的凝胶周围能够看到水解区域，区域的大小与酶的含量成正比。在某些情况下，还可以再加入其他试剂来显示水解的区域。如木聚糖酶活力的测定。这种方法虽然简单，但培养时间长。因为这种方法是根据区域的大小来确定酶的活性，所以其准确性要低于其他非扩散的方法。2.5 比浊法以酵母或酵母细胞壁在缓冲溶液中的浊度或吸光度的降低来表示酶活力，如 - 葡聚糖酶活力的测定。2.6 体外模拟消化技术酶活测定毕竟不能反映外源酶在机体内真实的作用效果，因此，对于体外法评定饲料营养价值的研究不断增加。体外法评定饲料营养价值是通过模拟消化道内温度、pH、消化酶分泌、胃肠运动和养分吸收等参数，在体外建立一套与畜禽消化道内环境接近的操作程序，对饲料及酶制剂进行营养价值预测和评定。常用的体外模拟消化技术包括：胃蛋白酶胰酶法；胃蛋白酶小肠液法；胃蛋白酶胰酶瘤胃液法；胃蛋白酶胰酶碳水化合物酶法。由于不同的饲料用酶是不同的微生物通过发酵过程产生的，酶产品的酶学性质差别较大。并且各种微生物所分泌的酶的最佳 pH 值、温度和对底物的亲和性都不相同。而目前，饲用酶除植酸酶、纤维素酶和 - 葡聚糖酶有正式颁布的国标或行标酶活测定方法外，其他饲用酶制剂目前都还没有一个统一的定义及检测标准。因此，饲料厂家在比较不同厂家的酶制剂时，在没有统一的测定方法情况下，应首先确定自己认可的检测方法，然后在完全相同的测定条件进行检测，这样得出的结论才具有可比性。3 酶制剂活性测定影响因素的分析饲用酶制剂活性测定的主要影响因素有温度、pH、作用时间、底物等 4 大要素以及一些非定义要素，如酶液稀释度、标准曲线、显色剂、缓冲液等，下面就这几方面进行归纳分析一下：3.1 影响饲用酶制剂活性测定的四大要素所谓的酶活性都是指在特定的系统和条件下测到的反应速度。为了确保酶制剂测定结果的一致性，饲用酶制剂活性单位定义中对影响酶活大小的主要条件进行了规定，其中包括温度、pH 值、时间和底物，这些都是酶活力测定系统中最重要的因素，对酶促反应速度影响很大。3.1.1 温度对酶活测定的影响。酶制剂对温度非常敏感，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要。温度对酶活性影响主要表现在两个方面，一方面是当温度升高时，酶与底物的反应速率加快；另一方面由于随着温度的升高将使酶的稳定性下降，部分酶蛋白分子逐渐变性而失去活性，引起酶反应速率下降；温度的这两种影响的综合作用而产生酶反应的“最适温度”。对于不同的酶制广东饲料 第1 8卷第3期2 0 0 9年3月 检 测 分 析 37剂在不同的情况下最适温度是有一定的差别。研究木聚糖酶时发现，在 3040条件下酶活较稳定，50后随着温度的升高，酶活力开始下降，90时基本失活（李卫芬等，1999）。研究纤维素酶最适酶解条件时发现，在 3658之间纤维素酶相对酶活随着温度升高而升高，当温度在 5862之间时，相对酶活性没有明显变化，曲线近似呈水平状态，在 40、45、50条件下，其相对酶活分别为 56%、70%、80%，而当温度大于 58以上时相对酶活不再升高（王琳等，1998）。同时，酶在不同条件下适宜温度也可能要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂以及酶促反应时间等因素的影响。3.1.2 pH 对酶活测定的影响。pH 值在酶活测定时对测定结果影响很大，各种酶制剂在一定条件下都有其特定的最适酶解 pH，酶的最适 pH 会随着底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适 pH 也只有在一定条件下才有意义。pH 影响酶活力的原因可能有以下几个方面：过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，也影响酶活性部位催化基团和结合基团的解离状态，酶活性丧失；当 pH 改变不是很剧烈时，酶虽未变性，但酶活受到了影响。pH 影响了底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物。pH 影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低可能影响到中间络合的解离状态，不利于酶解生成产物；pH 影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性；pH 影响底物的带电状态。这些都直接影响酶和底物的亲和力，影响酶解反应速度（王静等，2003；李险峰等，2000）。有文献报道，很多酶 最 适 酶 解 pH 都 在 3.0 6.0 （Nakamura 等 ，1997）。研究不同 pH 值对嗜热毛壳菌木聚糖酶活性的影响发现，在 pH 值 3.6 以下，随着 pH 值的增大，木聚糖酶的活性逐渐升高；pH 值为 3.6 时，木聚糖酶的活性最高，且在 3.24.4 范围内木聚糖酶的活性维持较高浓度，维持嗜热毛壳菌木聚糖酶活性的适宜的 pH 值范围应为 3.24.4 （爱娜等，2006）。杨会涛等（2006）研究 pH 对木聚糖酶活性影响的结果表明，该酶的最适反应 pH 为 6.0。洪枫等（2008）在研究木聚糖酶最适 pH 值时指出，里氏木霉 RutC-30 合成的木聚糖酶最适 pH 值范围在4.05.0 之间，pH 值对木聚糖酶的酶活影响很大。3.1.3 作用时间对酶活测定的影响。酶催化反应的动力学表明，酶解是一个有一定时间差的过程，当酶解产物达到一定浓度后会对酶产生反馈抑制作用，因而反应速度随着时间延长会越来越慢，所以酶解并非酶解时间越长越好。测定木聚糖酶酶促反应开始至 30min 内的产物生成量，结果表明13min 内产物的吸光度随反应时间几乎呈线性增长，其斜率可以代表酶促反应的初速度，此后速度减慢(单位时间内产生的还原糖量呈下降趋势)，相对酶活逐渐降低（费迪波等，2004）。用 DNS 法测定纤维素酶活时反应 1min 后，酶作用底物产生的还原糖量随时间延长呈直线上升，5min 后还原糖量的增加变得比较缓慢，10min 后，曲线呈现水平状态，还原糖量不再增加，往后随着时间的延长相对酶活逐渐降低（王琳等，1998）。3.1.4 底物对酶活测定的影响。底物的选择对酶活的测定影响也很大。米氏方程表达了酶反应速度与底物浓度之间的定量关系，其反应方程式可表示为：ESESP+E，首先酶（E）和底物（S）作用形成中间产物（ES），然后形成产物（P）并释放出酶（E）。在此平衡反应中，底物（S）的浓度将影响反应速度。当底物浓度较低时，底物浓度与酶活性成正比关系；当底物浓度增加到一定浓度时，酶活将趋于一个极限值，这时酶已被底物所饱和，所以在测定酶活时，底物浓度应大于这个极限值，这样酶活性直接正比于酶浓度而与底物浓度无关，否则会极大地影响测定结果。研究底物浓度对木聚糖酶活性测定的影响结果表明：底物浓度对测定结果有较大影响，底物浓度越高，测定结果也越高；底物浓度在 0.0060.032g/mL 时，酶活性的升高与底物浓度呈显著正相关；当底物浓度升高到 0.032g/mL 以上时，酶活性随底物浓度的升高幅度趋缓（聂国兴等，2002）。研究底物对纤维素酶活性测定影响的结果表明，以 Sigma 产 C5678 为底物，纤维素酶活性测定值明显高于上海产的羧甲基纤维素钠测定值，且C5678 浓度大于 3%后，其浓度对纤维素酶活性测定值无明显影响（顾赛红，2006）。3.2 影响饲用酶制剂活性测定的非定义要素分析在进行酶制剂的检测过程中，除了以上分析的几点酶活定义中规定影响饲用酶制剂测定结果的广东饲料 第1 8卷第3期2 0 0 9年3月 检 测 分 析 38因素外，酶活测定方法中还存在许多对酶活测定结果影响很大的非定义因素，这其中包括样品酶的稀释度、标准曲线的制作、显色剂的配置、缓冲液的离子强度等。3.2.1 酶液稀释度对酶活测定的影响。测定酶样时进行稀释可能带来两种效应，一是影响酶的稳定性，二是降低样品中原有抑制因素和辅助因素的浓度。目前测定酶活的方法通常是先把酶稀释，然后测定稀释酶的活力，所得到的结果乘以稀释倍数即为原酶的活力。但是，事实上许多酶的活力和稀释倍数并不成比例关系。选择酶样的稀释倍数实质上是选择酶分子与底物分子之间的数量比例，二者的比例只有在适当的范围内时酶蛋白的活力才与产物的生成量呈线性正比例关系。酶样稀释倍数过大会影响酶活的稳定性，稀释倍数不同最终获得的酶活测定值有很大差异（陆文清等，2002）。为探讨稀释率对木聚糖酶测定结果的影响，将酶样稀释度从 1 000 倍升至 11 000 倍，结果表明，稀释度的改变，明显影响酶活力测定结果，稀释度低，因吸光值太大使结果大大偏低；但稀释度过大因 A 值过小，结果也偏低。因此，测定时应规定合理的吸光值范围(以 0.20.5 为宜)，以获得相对稳定的测定结果。3.2.2 标准曲线对酶活测定的影响。标准曲线是酶制剂检测过程中能求出检测值的唯一对照依据，曲线方程的大小直接影响着换算出来的测定值。为了减少系统误差给测定带来的影响，标准曲线制作时应尽可能和样品在同一条件下反应。标准曲线的制作一般可以采用相对法和绝对法两种形式，相对法是借助已知准确含量的酶标准对照品作标准曲线，绝对法则是用一些酶活定义中规定的反应产物来衡量酶解产物作标准曲线。相对于绝对法，相对法测定结果精度高，速度快，费用低。分析来自不同实验室的测定结果表明，两种方法的精确度有近 3 倍的差异（张若寒，2001）。绝对法适用于法定的质量认证及仲裁机构，为一般单位常规测定提供基准物质，相对法适用于一般有日常测定需要的机构或企业。3.2.3 显色剂的配置对酶活测定的影响。在酶制剂检测反应的最后都要对反应产物进行显色，并用不同的方式对比产物生成的量，一般应用分光光度计法较多，也有用滴定法等其他方法。其中，显色剂类型的不同、相同显色剂但其中物质配比的不同、显色剂在反应中添加量的不同以及显色时间的不同，都会产生不同的反应结果，对酶活检测的值也会产生一定的影响。植酸酶酶活测定的机理都是利用酶水解植酸钠底物形成无机磷，然后测定无机磷的释放量，采用四种显色方法对比测定植酸酶反应产生的无机磷，分别是：丙酮磷钼酸铵法、钒钼酸铵法、维生素 C钼蓝法、钼蓝法，对比结果表明，丙酮磷钼酸铵法较其他三种方法更具有优势（黄遵锡等，1999）。聂国兴（2002）研究了 DNS 量对木聚糖酶活性测定的影响，结果表明：由于 DNS 用量变化，测定结果也发生了明显