千层金叶片化学成分初步研究.docx

千层金叶片化学成分初步研究 千层金叶片化学成分初步研究 千层金（Melaleuca bracteata）属桃金娘科白千层属，又名黄金香柳、黄金宝树，为常绿小乔木或灌木。千层金生长快，适生范围广，分枝性强，耐修剪，且株型直立，枝条柔软细长，叶片全年呈金黄色或鹅黄色。作为一种不可多得的色叶树种，千层金在园林上的应用越来越广泛。千层金叶片富含植物精油，芳香宜人，具有很强的杀虫和杀螨效果。此外，千层金还具有重要的药用保健价值。在南非，当地人用千层金缓解头疼，还用其作为烹饪时包裹食物的材料，或加工成床席2-4。 目前，关于千层金的研究主要集中在栽培技术、组织培养方面，而对其化学活性成分方面的研究只有少量报道，且多集中在精油方面。千层金叶片中所含有的化学成分比较复杂，种类繁多，至今还未见有关千层金叶片化学成分系统研究的报道。该研究对千层金叶片中各类化学成分进行定性分析，初步确定千层金叶片中可能含有的化学成分种类，并对其总多酚、总黄酮以及总多糖活性成分进行了定量分析，旨在为千层金的进一步研究和开发利用提供依据。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1样品。千层金叶片取自福建农林大学，选取无机械损伤、无病虫害千层金枝条，洗净晾干后，将叶片采下，冻干，粉碎，过40目筛，于-20 下保存备用。 1.1.2试剂。乙醇、乙酸乙酯、石油醚（沸程6090 ）、盐酸、氢氧化钠、茚三酮、硫酸铜、α萘酚、三氯化铁、铁氰化钾、香草醛、溴酚蓝、浓氨水、氯仿、浓硫酸、醋酸镁、硼酸、硅钨酸、氢氧化钾、盐酸羟胺、3，5-二硝基苯本文由收集整理甲酸、苦味酸、亚硝酸铁氰化钠、磷钼酸、香草醛等均为分析纯。没食子酸标准品、芦丁标准品、葡萄糖标准品（Solarbio，纯度≥98%）。 1.1.3仪器。FW177中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、LGJ25C冷冻干燥机（北京四环科技仪器厂有限公司）、BAS224S电子分析天平（Sartorius公司，德国）、DTY5A超级智能恒温循环器（北京德天佑科技发展有限公司）、N1001旋转蒸发仪（EYELA公司，日本）、U2900紫外/可见分光光度计（Hitachi公司，日本）、5810R离心机（Eppendorf公司，德国），MB3basic振荡器（IKA公司，德国），HYGB摇床（苏州培英试验设备有限公司）、SCIENTZIID超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）等。 1.2研究方法 1.2.1样品供试液制备。 1.2.1.1水供试液。 称取千层金叶片粉末30 g于锥形瓶中，加入300 ml蒸馏水，于摇床振荡（30 ，180 r/min）提取 24 h后，再超声提取2 h（300 W）。水提取液经离心、减压抽滤除去滤渣后，得到水供试液，检测氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、苷类、鞣质、有机酸、皂苷等物质。 1.2.1.2乙醇提取液。 （1）乙醇供试液。称取千层金叶片粉末30 g于锥形瓶中，加入300 ml 95%乙醇，于摇床振荡（30 ，180 r/min）提取24 h后，再超声提取2 h（300 W），离心过滤，即得乙醇供试液，检测黄酮、蒽醌、酚类、鞣质等物质。 （2）酸水供试液。取2/3乙醇供试液，减压浓缩至无醇味，加入30 ml 5%盐酸，充分搅拌后过滤，所得滤液即为酸水供试液，检测生物碱。 （3）乙酸乙酯供试液。将（2）中酸水解不溶的部分用30 ml乙酸乙酯溶解，然后用30 ml 5% NaOH溶液振摇洗涤2次，弃去碱水层。乙酸乙酯层继续用蒸馏水洗至中性，弃去水洗层，将剩余液体减压旋蒸除去乙酸乙酯后，用15 ml 95%乙醇进行溶解，得到乙酸乙酯供试液，检测香豆素、内酯、强心苷等物质。 1.2.1.3石油醚供试液。 称取千层金叶片粉末30 g于锥形瓶中，加入300 ml石油醚（6090 ），于摇床振荡（30 ，180 r/min）提取24 h后，再超声提取2 h（300 W），离心过滤，减压浓缩至30 ml，即得石油醚供试液，检测挥发油、油脂类物质。 1.2.2化学成分预试验。采用试管法和纸色谱法，根据各供试液可能含有的化学成分类型，选择经典的特异显色反应、沉淀反应等，对千层金叶片中的化学成分进行定性分析。 1.2.3总多酚、总黄酮和总多糖含量测定。 1.2.3.1总多酚含量测定。标准曲线绘制：采用FolinCiocaheu法。精密称取干燥至恒重的没食子酸5.0 mg，用水溶解定容至100 ml，即为没食子酸标准溶液。分别精确吸取没食子酸标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 ml于棕色容量瓶中，加蒸馏水至11 ml，并以蒸馏水为对照。然后，分别依次加入FolinCiocaheu试剂1 ml、75 g/L Na2CO3溶液8 ml，摇匀，在室温下避光静置1 h，于760 nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标、相应没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=94.030 0x+0.010 0，R2=0.996。 样品总多酚含量的测定：称取千层金叶片粉末4.00 g于锥形瓶中，加入40 ml 50%乙醇水溶液，超声（300 W）提取15 min，离心，取上清液稀释100倍后吸取1 ml，按标准曲线方法测定吸光值。将吸光值代入标准曲线方程计算样品中总多酚含量，结果以等量的没食子酸表示，即mg GA/g（GA，gallic acid，没食子酸）。 1.2.3.2总黄酮含量测定。标准曲线绘制：采用Al（NO3）3NaNO2比色法。精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10.0 mg，用60%乙醇溶解定容至50 ml，即得0.2 mg/ml芦丁标准溶液。分别精确吸取芦丁标准溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml于25 ml容量瓶中，加60%乙醇溶液至10 ml，并以60%乙醇为对照。然后，加入1 ml 5% NaNO2溶液，摇匀静置6 min后，加入1 ml 10% Al（NO3）3溶液，摇匀静置6 min，再加入1 ml 4% NaOH溶液，最后用60%乙醇定容至25 ml，摇匀后放置15 min，在500 nm波长处测定吸光值。以吸光值为纵坐标、相应芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=6.032 7x-0.001 3，R2=0.999。 样品总黄酮含量的测定：称取千层金叶片粉末4.00 g于锥形瓶中，加入40 ml 50%乙醇水溶液，超声（300 W）提取15 min，离心，取上清液1 ml，按标准曲线项下方法进行测定。将吸光值代入标准曲线方程计算样品中总黄酮含量，结果以等量的芦丁表示，即mg RT/g（RT，rutin，芦丁）。 1.2.3.3总多糖含量测定。标准曲线绘制：采用苯酚-硫酸比色法。精密称取葡萄糖标准品2.5 mg，用蒸馏水溶解定容至25 ml，即得0.1 mg/ml葡萄糖标准液。精密吸取01、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准液于容量瓶中，分别加水至1 ml，再加入1 ml 5%苯酚，摇匀后加入5 ml浓硫酸，振荡混匀，静置5 min。经沸水浴15 min后，迅速在冰水浴中冷却至室温，并放置30 min，于490 nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标、相应葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=42.564 0x+0.009 7，R2=0.999。 样品总多糖含量测定：称取千层金叶片粉末1.00 g于锥形瓶中，加入20 ml蒸馏水，100 水浴浸提2.5 h，离心，取上清液2 ml，加入10 ml 95%乙醇醇沉30 min，再离心弃去上清液，用5 ml蒸馏水将沉淀溶解，取200 μl按标准曲线项下方法进行测定。将吸光值代入标准曲线方程计算样品中总多糖含量，结果以等量的葡萄糖表示，即mg GC/g（GC，glucose，葡萄糖）。 2结果与分析 2.1化学成分检测结果水供试液、乙醇提取液和石油醚供试液化学成分检测试验结果分别见表13。由表13所显示的结果可以初步判定千层金叶片中可能含有氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、苷类、酚类、鞣质、间二苯酚、间苯三酚化合物、有机酸、黄酮类、香豆素、内酯类、强心苷、挥发油、油脂类、萜类、甾醇类等物质，并证明不含皂苷、生物碱、蒽醌类物质。 表1水供试液检测结果 检测成分检查方法试验现象判定 结果氨基酸、多肽、蛋白质茚三酮反应溶液呈蓝紫色+双缩脲反应溶液呈紫红色+沉淀反应 溶液变浑浊，有沉淀产生+ 糖类、多糖、苷类Fehling反应有砖红色沉淀+Molish反应 与浓硫酸接触面有紫红色环产生+ 酚类、鞣质三氯化铁试验溶液呈蓝绿色+三氯化铁-铁氰化钾试验滤纸片上斑点呈蓝色+ 明胶试验有白色沉淀产生+间二苯酚、间苯三酚化合物香草醛-盐酸反应斑点呈现不同程度红色+ 有机酸pH试纸试验呈酸性+溴酚蓝试验呈蓝色背景黄色斑点+皂苷 泡沫试验 极少泡沫产生，静置几分钟后泡沫消失- 注：表中+表示正反应，-表示负反应。下同。 2.2总多酚、总黄酮和总多糖含量测定结果试验结果表明，千层金叶片干样中总多酚含量为43.56±0.76 mg GA/g，总黄酮含量为11.34±0.20 mg RT/g，总多糖的含量为16.13±0.32 mg GC/g。表2乙醇提取液检测结果 供试液检测成分检查方法试验现象判定结果乙醇供试液酚类、鞣质三氯化铁-铁氰化钾试验滤纸片上斑点呈蓝色+黄酮类盐酸-镁粉试验产生泡沫，并由红色变为紫红色+三氯化铝试验斑点在紫外灯下呈黄绿荧光色+氨熏试验紫外灯下斑点呈黄色荧光+蒽醌类碱液试验加碱变红色，加热后红色消褪-醋酸镁试验无明显现象-硼酸溶液试验无明显现象-间二苯酚、间苯三酚化合物香草醛-盐酸试验斑点呈不同程度红色+酸水供试液生物碱硅钨酸试验无明显现象-乙酸乙酯供试液香豆素、内酯类荧光试验紫外灯下斑点呈蓝色荧光，喷洒KOH后变为黄绿色+异羟肟酸铁试验溶液呈紫红色+强心苷碱性苦味酸试验溶液呈红色+3，5-二硝基苯甲酸试验溶液呈紫色+亚硝酸铁氰化钠试验溶液显红色后逐渐消失+ 表3石油醚供试液检测结果 检测成分检查方法试验现象判定 结果挥发油油斑试验油斑挥发无痕迹+油脂、三萜、甾醇类磷钼酸试验藏青色背景呈蓝+3色斑点挥发油、萜类、甾醇类香草醛-硫酸试验斑点呈蓝色、紫色+ 3结论与讨论 （1）已有的报道表明，千层金叶片中含有挥发油、氨基酸、酯类和萜类化合物。Naidu从千层金中提取得到了反式4羟基N甲基脯氨酸；Tshibangu等从千层金叶片中分离得到2种酯类化合物桦木酸酯和熊果酸乙酸酯；Adesanwo等从千层金中分离得到2种三萜类化合物，并鉴定为白桦脂酸和齐墩果酸。该试验利用植物中有机成分与专属试剂发生显色或沉淀反应的原理，采用试管法和滤纸片法，检测到千层金叶片中含有挥发油、氨基酸、酯类、三萜类化合物、多肽、蛋白质、糖类、苷类、酚类、鞣质、间二苯酚、间苯三酚化合物、有机酸、黄酮类、香豆素、内酯类、强心苷、油脂类、甾醇类等物质。化学预试法虽简便易行，但各类定性试验均有例外，且植物叶片所含成分复杂，存在相互干扰的问题，故此法只能提供初步线索。此外，有些含量低的成分，通过预试验方法也很难测定出，因此仅凭化学预试法来判定某种成分是否存在是不全面的，还需结合文献报道或利用化合物标准品进行对照试验或采用高效液相色谱或高效液相色谱质谱联用技术等进行进一步确定。 （2）试验对千层金叶片中的总多酚、总黄酮和总多糖进行了进一步定量分析，结果可知千层金叶片冻干样中总多酚、总黄酮、总多糖的含量分别为43.56±0.76 mg GA/g、11.34±0.20 mg RT/g、16.13±0.32 mg GC/g。肖越采用