生物技术综合实验指导手册.doc

鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业生物技术综合实验实验指导生物技术综合实验实验指导适用专业：生物技术鲁东大学生命科学学院编写：应用生物工程教研室2010年目 录第一部分、综合性实验4综合项目一、-淀粉酶产生菌的分离与筛选4实验一、培养基配制及样品采集4实验二、样品处理及初筛5实验三、-淀粉酶产生菌的分离与筛选6综合项目二、酵母菌的诱变育种8实验四、培养基配制和菌种活化8实验五、酵母菌的诱变处理9实验六、呼吸缺陷型菌株的初筛10实验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证11综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺12实验八、谷氨酸菌种的制备12实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制13实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制15综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取17实验十一、红曲液体菌种的制备17实验十二、红曲固体发酵18实验十三、红曲色素的提取及色价测定19 综合项目五、糖化酶的发酵和提取.22 实验十四、培养基的配制和菌种活化 实验十五、糖化酶的摇瓶发酵 实验十六、糖化酶的提取、浓缩、活性测定第二部分：设计性实验25设计性实验要求25设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸26设计项目二、 固体发酵法生产柠檬酸29设计项目三、-淀粉酶生产32设计项目四、酵母细胞的固定化33第三部分 附录36附录一、中试发酵设备的使用方法36附录二、气升式生化反应器的使用38附录三、发酵液中还原糖的测定方法40附录四、谷氨酸浓度测定法42附录五、-淀粉酶的测定方法43附录六、糖化型淀粉酶活力的测定45附录七、柠檬酸的检测 48附录八 原料中粗淀粉的测定 .49实 验 守 则一、实验1、 实验前认真做好课本有关章节的阅读及实验讲义的预习，简单了解实验装置的构造，掌握有关测量仪表的使用方法，确定实验方法和步骤，做好实验原始数据的记录。2、 指导教师在实验前进行提问，如发现没有达到预习要求的同学，有权停止其参加当次实验。3、 操作过程应在装置指定范围内进行调节，注意观察实验现象，正确读取实记录。4、 注意节约水电、药品、物品、爱护仪器设备，实验结束，将设备、仪器整理复原，场地清扫，与实验无关的装置仪器不得挪用。5、 实验室内保持安静，不得高声谈笑、喧闹，违者按破坏课堂纪律处理，实验结束后，所测数据经指导教师许可，方可离开。二、实验报告1、 实验报告内容包括：实验原理、流程简图、操作要点、数据图表（附原始记录、计算示例）主要结论，实验结果的分析。2、 实验报告写在报告纸上，三天内交给指导教师。三、注意事项1、 不碰摸与本实验无关的电源开关、电气设备、仪器。2、 仪器设备转动前，注意其周围是否有阻碍物，若发热或声音不正常，应及时停车检查。3、 注意防止高压容器泄露和蒸汽管道烫伤事故的发生。第一部分、综合性实验综合项目一、-淀粉酶产生菌的分离与筛选实验一、培养基配制及样品采集一、实验目的学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握-淀粉酶筛选的特异性培养基配制方法。二、实验原理自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。三实验材料1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、记号笔等。2. 筛选培养基：斜面肉汤琼脂 + 1%可溶性淀粉四、操作步骤1. 采样：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在1030cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。（注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。从土层的纵剖面看，15cm的表层土，由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比525cm的土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是525cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到，如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约510cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。）2筛选培养基配制：筛选培养基配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，可溶性淀粉10，琼脂粉15，pH 7.5。每500ml三角瓶装200ml培养基，121灭菌20min，备用。LB培养基斜面：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂粉15，pH 7.5。培养基装试管，灭菌后摆斜面，备用。3无菌水制备100ml三角瓶，加入9 ml蒸馏水，玻璃珠8颗，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。试管10支，装9ml/支蒸馏水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。培养皿包封，灭菌后备用。1ml吸管若干，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。涂布棒包扎后灭菌，备用。五、思考题1你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？实验二、样品处理及初筛一、实验目的学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法及透明圈法进行产-淀粉酶产生菌的初筛的技术。二、实验原理菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。枯草芽孢杆菌在自然界中分布很广，常用来生产-淀粉酶，在含淀粉质较多的环境中经常能够找到。由于其体内能够产生芽孢，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热的微生物杀死得以富集。透明圈法是常见的初筛方法。在含有淀粉的平板上，由于枯草杆菌能够产生淀粉酶，因此，可将菌落周围的淀粉酶解掉，形成透明圈。所以，我们可以根据是否产生透明圈，来初筛目的菌。三、实验材料1. 培养基：筛选培养基。2. 试剂：芽孢染色液、碘-碘化钾溶液。3. 其他器具：超净工作台、显微镜、培养皿、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接种环、酒精灯等。四、操作步骤1样品稀释：称取土样1g，加入到备好的玻璃珠和无菌水的三角瓶内，振摇5 min。根据微生物稀释方法操作，稀释到103106。2加热处理：将最后三支土样稀释液，置于100沸水浴35 min，灭活营养细胞，保留芽孢。3涂布平板和培养：筛选培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取0.1ml涂布平板，30倒置培养。五、思考题你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？实验三、-淀粉酶产生菌的分离与筛选一、实验目的学习从初筛菌株中进行目标菌株的挑选以及复筛的方法技术，掌握透明圈法、变色圈法进行产-淀粉酶产生菌的复筛的技术。二、实验原理分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液进行鉴别，根据菌落周围是否出现透明圈来分离淀粉酶产生菌。透明圈与菌落直径的比例，可以反映菌株产酶能力的大小。三、实验材料1. 碘液制备原碘液：称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g，注意：碘不好溶解，需要用研钵捣碎，最后达到完全溶解为之，定容至500mL，贮于棕色瓶内。稀碘液：取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL ,贮于棕色瓶内。四、操作步骤1单菌落挑取：对平板上生长的单菌落进行编号，挑单菌落接种试管斜面保存（编号），并分别接种在同样平板培养基上，每个培养皿接不同的菌落4株（编号和标记）。置30培养箱培养。2初筛平板定性观察：初筛平板浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。记录有淀粉酶产生的菌种号。3复筛平板的定性观察和定量测定：培养二天后，浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。测量菌落直径与透明圈直径大小，计算透明圈直径/菌落直径的比值，挑取透明圈与菌落直径比大的菌株，用于做进一步的摇瓶筛选。五、结果与讨论提出一个你自己的更加高效、合理的菌株复筛方案。综合项目二、酵母菌的诱变育种实验四、培养基配制和菌种活化一、实验目的学习制作适合于诱变处理的细胞的制备。二、实验原理通过人工方法可以使微生物发生突变，其突变率远远高于自发突变。再经过筛选和选育，可以简便、快速地筛选出不同类型的突变株，供生产和研究之用。人工诱变的突变是不定向的，但选择可以是定向的。 用来诱发突变的菌株称为出发菌株。出发菌株可以是自然界中分离出来的野生菌株，可以是生产中应用的自发突变菌株，也可以是已经诱发过的菌株。诱变处理时应选择菌体生长的敏感期，如菌体的对数期，孢子或芽孢的萌发前期。选择孢子、芽孢，因其多为单核状态。一般制成单孢子或单细胞悬液，目的是能均匀接触诱变剂，并能减少诱变后件状的分离及退化现象。三、实验材料1.菌株：酒精酵母2.CM培养基：葡萄糖 40g MgSO4 2g蛋白胨 10g 琼脂 15g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO4 5g不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。3.TTC上层培养基葡萄糖 5g TTC（红氮四唑） 0.5 g琼脂 10g 水 1000ml 分装，58.84kPa灭菌 15min。4.TTC下层培养基葡萄糖 10g MgSO4 7H2O 0.4g蛋白胨 2 g 琼脂 20 g酵母膏 5 g 水 1000 mlKH2PO4 1 g pH 5.55.75.MM甘培养基酵母膏 6.7 g 甘油 20 ml水 980 ml pH 5.5琼脂粉 20 g 分装，58.84kPa灭菌 10min。6培养皿、涂布棒、稀释试管若干，1ml移液管（棉封）若干，牙签若干，包扎后灭菌备用。7.恒温震荡器、培养箱四、操作步骤1. 菌种活化：保存菌种转接CM培养基斜面，30培养活化2天。2. 培养基制备及其它材料的准备：按照要求准备各种实验用培养基，灭菌后备用。3. 其它材料按要求准备：按照要求准备其它玻璃器皿，灭菌备用。五、结果与讨论讨论酵母细胞诱变处理的敏感期可以选择哪个阶段？试验五、酵母菌的诱变处理一、 实验目的学习和掌握微生物的诱变处理方法。二、实验原理不同诱变剂诱变的作用强弱不同。微生物诱变剂常用紫外线、硫酸乙二脂、烷化剂等。诱变剂选择的原则是使用的方便性和有效性，获得高正变株出现率的就是有效诱变剂。诱变剂多为致癌剂，操作时要注意安全。诱变剂剂量选择及处理时间一般以杀菌率控制。目前常采用剂量是杀菌率为30（70）80%，杀菌率取决于剂量和作用时间及作用距离。用高剂量诱变剂处理获得的负突变率高，而在低的剂量中正突变率反而较高。三、实验材料1.溴化乙锭2.TTC（红氮四唑）四、操作步骤1将准备好的CM固体培养基溶化后倒平皿，过夜，（检验是否无菌，干燥）。2取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基中，并加入诱变剂溴化乙锭10g/ml，120rpm 、30震荡培养过夜，进行诱变处理。五、结果与讨论简述溴化乙锭的诱变作用机理。试验六、呼吸缺陷型菌株的初筛一、 实验目的学习和掌握呼吸缺陷型菌株的初筛方法。二、实验原理许多突变株在菌落形态上会发生变异，所以通过观察菌落形态特征挑出突变株是进行初筛的有效手段之一。在酵母中，呼吸缺陷型突变株是经常遇到的。在平皿培养后，一般为小菌落，这些小菌落丧失呼吸能力。产生这种变异的原因， 主要是细胞质基因发生突变，但有时核基因也会突变。小菌落突变后，对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。同样，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。三、实验材料1TTC下层培养基2TTC上层培养基3灭菌的培养皿四、操作步骤1将诱变处理过的酵母培养液适当稀释（稀释度初步10-3、10-4、10-5），涂布CM培养基平板，涂布后30培养24h。2TTC下层培养基倒平板。3将CM培养基平板上长出的菌落点种TTC下层平板上，30培养3d。4. 培养3天后，将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。等凝固后，30培养23h。此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。呼吸缺陷型突变株为白色菌落。五、结果与讨论讨论呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。试验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证一、 实验目的学习和掌握呼吸缺陷型验证方法。二、实验原理呼吸缺陷型酵母突变株对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，因此不能在以甘油为唯一碳源的培养基上生长，利用这一特性可以进行呼吸缺陷型突变株的验证。三、实验材料1.CM培养基2MM甘培养基3灭菌的培养皿4无菌牙签。四、操作步骤1 用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。30培养1d。2 观察记录MM甘培养基和CM培养基上菌落的生长状况，验证白色的小菌落是否是呼吸缺陷型突变株。五、结果与讨论如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺实验八、谷氨酸菌种的制备一、 实验目的：了解发酵工业菌种的制备工艺流程和质量控制方法，并为本发酵实验准备菌种。二、 实验原理：谷氨酸棒杆菌是一种好氧性细菌，在合适的培养基上经摇瓶培养能快速生长，可得到大量健壮的种子。处于旺盛生长的生长对数期的菌体适合作为种子。三、 实验器材和药品：试管、三角瓶、抽滤瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜等。四、 实验步骤：1.斜面种子的制备将试管洗净，做好棉塞，并7支一组捆扎好，空消：0.10MPa，30min。按配方配制斜面培养基，加热将培养基溶解后分装到已消好的空试管中，装量约为1/5，灭菌后并摆成斜面。将做好的斜面37空培24h，检查确定无菌后备用。将保存的斜面菌种上的菌苔划线接种到新制斜面上，37培养24h，制成斜面菌种。斜面培养基配方： 葡萄糖0.1% 蛋白胨1% 牛肉膏1.0% 氯化钠0.5% 琼脂2.0% pH值7.0灭菌条件：0.1MPa，30min2.一级种子培养培养基配方： 葡萄糖 ：2.5% 尿素：0.5% 硫酸镁：0.04% 磷酸氢二钾：0.1% 玉米浆粉：0.50.6% 硫酸亚铁：2mg/L硫酸锰：2mg/L pH 7.0 在500mL三角瓶中装入50mL培养基，8层纱布封口，0.10MPa表压灭菌30min，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。置旋转摇床上培养12h（转速170190 r/min），培养温度3032。3.二级种子培养 培养基配方： 葡萄糖 ：2.5% 尿素：0.34% 硫酸镁：0.04% 磷酸氢二钾：0.16%玉米浆粉：0.50.6% 消泡剂：0.086ml/LpH 7.00.08MPa表压，30min灭菌，冷却接种后，摇床78h。二级种子的制备量按发酵罐投料量的10%的量准备。五、思考题种子制备过程中应注意哪些事项？实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制一、 实验目的了解发酵罐的操作程序和注意事项，完成谷氨酸发酵的全过程操作。二、 实验原理谷氨酸的生物合成包括EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、二氧化碳的固定反应等。谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，但谷氨酸脱氢酶活性很强，同时NADPH2再氧化能力弱，这样使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有NH4+存在时，经过谷氨酸脱氢酶作用和还原氨基化反应生成谷氨酸。三、 实验装置发酵罐系统（发酵罐，蒸汽发生器，空压机）、恒温培养箱、分光光度计等。四、 实验步骤1. 投料投料量：按发酵罐体积的70%配料。配方： 葡萄糖： 160g/L 尿素 5 g/L 硫酸镁： 0.5 g/L 磷酸氢二钾： 1.5 g/L 玉米浆 2535 g/L 硫酸亚铁 20mg/L 硫酸锰 20mg/L pH 7.0 2. 实消注意罐压，控制0.10.11MPa，15min，通过蒸汽流量调节。3. 接种接种量为10%，通过接种管接种。4. 发酵过程控制（1） 温度控制：谷氨酸发酵前期为菌体生长期，最适温度3032，后期为谷氨酸产生期，产酸期温度控制在3436。（2） pH控制：发酵过程中产物的积累会导致pH下降，而流加氮源（氨水、尿素）会导致pH升高。发酵中当pH降到7.07.1时，应及时流加氮源。菌体生长期（012h）控制pH不大于8.2（由尿素流加量、风量和搅拌转速来调节）；产酸期（12h以后）控制pH 7.17.2。（3） 发酵过程中参数的记录和分析：pH 2小时1次 pH计还原糖 3小时1次 斐林试剂滴定法谷氨酸 3小时1次附录方法菌体生长量 2小时1次 752分光光度计OD620nm温度 2小时1次 温度计风量 2小时1次 气体流量计5. 放罐残糖5g/L以下，耗糖速率缓慢时放罐。四、实验结果与讨论以时间为横坐标，OD620nm、残糖量、谷氨酸量为纵坐标，绘制发酵过程中参数变化曲线。实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制一、 实验目的1. 了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法。2. 掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。3. 掌握脱色、浓缩、结晶等单元操作的原理和方法。二、 实验原理谷氨酸的分离提纯，通常应用它的两性电解质的性质。通过谷氨酸的溶解度、分子大小、吸附剂的作用以及谷氨酸的成盐作用等，可以把发酵液中的谷氨酸提取分离出来。三、 实验器材无极速搅拌机、旋转蒸发器、恒温水浴锅、水环式真空泵、pH试纸、盐酸。四、 实验步骤（一） 等电点回收1. 流程发酵液离心除菌体（5000rpm, 10min）加盐酸育晶2h（pH 45）加盐酸育晶2h（pH3.53.8）加盐酸育晶2h（pH 3.03.2）加盐酸搅拌育晶20h沉淀4h母液和细谷氨酸。2. 等电点操作（1） 先测定发酵液的体积、pH、谷氨酸含量和温度。若放罐的发酵液温度高，应先将发酵液的温度冷却到2530，消除泡沫后再开始调pH，用盐酸调到pH 5.0。（2） 当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，注意观察晶核形成情况，若有晶核形成，应停止加酸，搅拌，育晶24h。若发酵不正常，产酸低于4%，pH调到3.53.8左右。（3） 搅拌2h，以利于晶核的形成，或者适当加一点晶种刺激起晶。（4） 搅拌，育晶2h后，继续加酸，耗时46h，调pH至3.03.2，搅拌2h后开大冷却水降温，使温度尽可能降低。（5） 到等电点pH（3.2）后，继续搅拌16h以上，停止搅拌静置沉淀4h，关闭冷却水，吸去上层菌液，底部谷氨酸离心甩干。（二） 谷氨酸钠的精制 回收的谷氨酸又称麸酸，并没有鲜味，用碳酸钠中和精制，在pH7.0左右得到谷氨酸一钠，在pH 910左右得到谷氨酸二钠。1. 流程：谷氨酸加水、活性炭、碳酸钠中和脱色过滤二次脱色滤液三次脱色过滤浓缩结晶干燥2. 操作（1） 工艺条件：湿谷氨酸：水=1：2湿谷氨酸：碳酸钠=1：0.30.34湿谷氨酸：活性炭=1：0.01T=60，pH6.4（用试纸测）（2） 在不锈钢桶内加入清水及活性炭升温至65，开始搅拌（60r/min）。投入谷氨酸，缓慢、逐步加入碳酸钠中和到pH6.4（试纸），加热至65，继续搅拌约30min。（3） 将澄清的脱色液加入旋转蒸发器（加料小于二分之一），真空度在600mmHg以上，温度小于70，浓缩至3434.5波美度，升温至80放料，冷却，搅拌23h后开冷却水降温，至室温。（4） 分离：抽滤（工业滤布做介质）（5） 烘干：鼓风干燥箱（温度小于60），即可得到味精原粉。五、思考题 分析影响谷氨酸结晶的因素？综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取实验十一、红曲液体菌种的制备一、实验目的了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。二、实验原理 红曲霉菌是一种好氧性微生物, 除了能进行固体浅盘培养外, 还可以用液体摇瓶培养的方法来获得种子。液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速等特种点。液体菌种应用于生产与固体菌种相比有以下优点：菌种生产周期短；接种后，萌发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。液体菌种为固态发酵的集约化、标准化生产创造了更好的条件。三、实验器材与试剂1菌种：红曲50032玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。 3恒温摇床, 超净工作台, 高压蒸汽灭菌锅等。四、实验步骤（1） 配制制玉米面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL, 包扎后 0.lMPa 灭菌 20 分钟。（2） 玉米面液体培养基灭菌冷却后 , 每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌操作 ) 。（3） 接种后置30恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。五、思考题 :比较液体种子与固体种子的优缺点。实验十二、红曲固体发酵一、实验目的了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。二、实验原理 红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。红曲霉作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素，是红曲霉的次生代谢产物，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，可以提高加工制品对光和氧稳定等优点；而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高，因此红曲可提供安全性高的天然色素。1979年，日本学者远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到能显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin K后，人们开始对天然红曲及Monacolin类化合物给予了新的广泛关注。美国FDA于1987年正式批准美降脂药(洛伐他汀，即Monacolin K)用于临床。迄今为止，美国和日本等已开发出一系列他汀类药物如Lovastatin、Provastatin、Simvastatin和Atorvastatin等，其主要成分即为Monacolin类化合物。我国用红曲开发的降血脂药物及保健食品有血脂康、脂必妥和健心宝等。药理及临床实验显示，红曲不但有降血脂、降血压、降血糖功效，而且还有明显抑菌、增强免疫力、抗疲劳的作用。国内红曲的生产现在普遍采用固态发酵的方法。 三、实验器材与试剂蒸锅, 浅盘等。制曲原料 : 优质籼米。四、实验步骤1 浸米 :25 以上浸米 58h, 大米吸收水分约在 28%30% 。2蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水, 沥干, 即可蒸米。上汽火力要强, 待全部圆气以后，蒸煮35min, 出饭率在 135%, 饭粒呈玉色, 粒粒疏松, 不结团块。蒸米不能熟透。3摊凉接种: 将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块, 摊平冷却到 3032 然后, 每 1kg 米接种液体种子20ml, 充分翻拌混合均匀,操作要迅速, 以减少杂菌污染。4发酵: 将曲料摊在曲盘内, 厚度约 3-5cm。3233 保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法: 一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水, 使曲粒表面润湿并微有发胀。培养3天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内5060鼓风干燥。5成品质量检查外观检查 : 曲粒表层光滑紫红, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香, 不得有酸气等不正常气味。生物与理化项目检查: 水分12%以下 , 容量 (l00mL)44.546.5g, 淀粉含量%, 无细菌和其他霉菌污染。五、注意事项 :注意发酵阶段控制品温。六、思考题 :影响红曲质量的因素有哪些 ?实验十三、红曲色素的提取及红曲色价测定一、实验目的熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。二、实验原理:红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素，其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin)，橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin)，紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系，结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物, 但这些产物的量非常少, 大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积, 为了降低运输成本, 常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水溶性组分, 也有脂溶性组分, 因此可用 80% 的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。选择溶剂一般要注意以下四点： 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。 溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。 沸点宜适中，便于回收反复使用。红色素能溶于80% 的乙醇中 , 可通过萃取从米粒中提取出来, 红曲色素在505nm 处有最大的吸收峰, 可用分光光度计来测定。三、实验器材与试剂旋转蒸发仪, 分液漏斗, 乙酸乙酯, 丙酮等，分光光度计,水浴锅,量筒,80%乙醇等四、实验步骤（一）色素提取：1、取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；2、将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)300mL；3、室温下浸提 1 天, 每隔 2 小时摇动一次, 过滤；4、沉淀用同样提取液洗涤 2 次, 每次 100ml, 合并滤液；5、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分 )；6、用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中；7、用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；8、以同样方法按下图分离碱(溶)性组分、中性组分和酸(溶)性组分, 观察各组分的颜色； 9、将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂, 低温保存。（二）红曲色价测定：1、称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中；2、加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀,60水浴保温萃取0.5h；3、取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至10mL；4、以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lcm 比色皿测定样品的吸光度。5、计算: 红曲色价(以lg样品计)=A505lO2注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。五、注意事项 :1. 无水 Na2S04 可回收, 反复使用, 不要扔掉。2. 有机溶剂易燃, 注意远离火源, 原则上应在通风柜中进行。六、思考题 :1为什么要用无水 Na2S04 脱水?2萃取后米粒中仍带有红色, 是否会对结果产生影响?附：红曲代谢产物分离工艺流程图综合项目五、糖化酶的发酵和提取实验十四、培养基的配制和菌种活化实验十五、糖化酶的摇瓶发酵实验十六、糖化酶的提取、浓缩、活性测定1 实验目的和要求（1）熟悉酶制剂的发酵过程；（2）熟悉酶制剂的超滤浓缩的原理与操作步骤；（3）熟悉无机盐沉淀和有机溶剂沉淀法提取酶的原理与操作步骤。2 菌种和培养基2.1 菌种：黑曲霉UV-112.2 培养基2.2.1 斜面培养基 土豆培养基2.2.2 麸皮种子培养基小麦麸皮：水=l：1.11.3：接种后于3032培养4-5天至长满丰富的孢子，中间翻曲。2.2.3 发酵培养基 玉米粉13.5%，豆饼粉3.5%，麸皮1.0%，玉米浆2.0%，无机盐3 实验仪器、设备（1）500ml摇瓶（2）恒温培养箱（3）真空抽滤装置4 实验过程4.1 总流程斜面培养 斜面培养基配制与灭菌，接种，培养。 所需仪器物品：灭菌锅，试管，棉塞，培养基原料，培养箱麸皮种子 500mL三角瓶三只，装料20克摇瓶培养 培养基的配制、调pH至4.0；灭菌；接种；转速为200转分钟；温度：32过滤离心沉 淀 有机溶剂沉淀（3.5倍无水酒精）；无机盐沉淀（55g/100ml硫酸铵）酶泥干燥 干燥温度404.2 摇瓶发酵按配方配制培养基（装液量700ml），调pH至4.0，加入摇瓶（每瓶80ml）中，121灭菌30min，冷却，待温度降至30-32，接入一个三角瓶的孢子悬液，在30、搅拌速度为200rp下培养 每隔12小时取样测定酶活、pH、还原糖及总糖浓度并作镜检。4.3 发酵液过滤真空抽滤，量取滤液体积；取样测定糖化酶活力。4.4 有机溶剂沉淀 取浓缩液，用盐酸调节pH至3.5。在1020条件下加入3.5倍冷冻的无水酒精，边加搅拌，即可发现酶的沉淀现象。沉淀物用布氏漏斗抽滤。称酶泥的重量，测定酶活。4.5 无机盐沉淀 取1L浓缩液，按55g/100ml加硫酸铵，静止盐析1h。沉淀物用布氏漏斗抽滤。称酶泥的重量，测定酶活。4.6 酶泥的干燥 将上述步骤中得到的酶泥防入干燥箱中，在40下以热风干燥，将干燥的制品磨粉即得成品。将成品称量并测定酶活。5 实验分析项目和方法5.1 黑曲霉镜检染料：草酸铵结晶紫液(A液：1结晶紫95酒精溶液：B液：1草酸铵溶液。取A液20mL，B液80mL混合，静置48小时后使用)镜检过程：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5.2 总糖的测定（参见附录）5.3 还原糖的测定（参见附录）5.4 糖化酶酶活力的测定（参见附录）5.5 pH的跟踪测定6 实验时间 五天7 实验报告内容和数据处理（1）作出发酵过程中总糖、还原糖、pH的时间变化曲线。（2）设计糖化酶提取试验报告表，计算总回收率。8 参考书（1）邬显章，酶的工业生产技术，吉林科学技术出版社，1988年（2）工业发酵分析，天津轻工业学院等，轻工业出版社，1980年第二部分：设计性实验设计性实验要求设计性实验是学生学习生物实验课程的必修项目之一，它包含了十余个实验项目。本学期开设了6个项目，学生根据课程要求，选修或必修其中若干课题。设计性实验教学以学生自主设计、独立实验为主，教师只起辅助性的指导作用。在设计性实验中，要求学生根据实验给定的实验器材条件来设计，完成该项实验内容。一、具体的程序和要求：1、自由选择实验项目，了解实验课题，明确工作任务，熟悉仪器。2、查阅有关资料，提出各种可能的实验，画出必要的原理图，推导出有关的理论公式。通过分析与比较，选择出能够满足实验要求的最佳实验方案。3、通过对测量仪器和误差传递公式的研究，对实验方法进行分析，确定出最合适的测量方法和测量条件，确定出数据处理方法。4、写出一份合格的实验设计方案，对实验方法进行分析。5、进行具体实验，观察有关现象，进行测量。在实验中发现问题、分析问题、解决问题。6、写出一份完整、合格的实验报告，报告的格式与一般实验的报告相同。学生们应在实验方案的选择，实验过程的控制和实验结果的分析上多下功夫。二、实验设计方案格式：设计性实验设计方案设计性实验（ ） 题目专业班级 姓名 指导教师 实验目的： 实验仪器用具： 设计思想与实验原理: 实验内容与步骤: 注意事项: 数据表格与处理方法:备注：在设计实验方案时，我们提倡同学们相互讨论，不支持相互参考，坚决反对相互抄袭。三、对于教学控制过程，要求如下：1、设计性实验的设计方案需经教师审阅签字后，方可进行实验操作；2、实验原始记录需经教师审阅签字后，方算完成了实验操作过程。3、学生交实验报告时，需把经签字的设计方案和原始记录作为报告的附件一并交来，如没有这两个附件视作未做实验。4、为了督促学生认真学习，促进学习积极性，激励他们多做实验，做好实验，凡是学生首次未设计好实验方案的，可以重新设计；未做好实验的，可以重做实验；未写好报告的，可以重做报告。四、注意学生们可以多选做实验项目，也可以多次作实验，请同学们在实验中开拓思维，提出更多、更好的实验方法和建议，并欢迎大家提出新的实验项目与想法。我们愿与同学们共同努力把设计性、研究性实验教学更进一步的开展起来。设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸一、实验目的了解柠檬酸发酵原理与过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。二、实验原理黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径和HMP途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄型”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：C6H12O6+1.5H2O C6H8O7+H2O柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。三、实验装置与流程（1）实验装置与材料：装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min）。菌种：黑曲霉CICC。材料：麸皮、马铃薯、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。器皿：15mL试管、100mL三角瓶、2000mL烧杯、500mL三角瓶、离心管若干。试剂：0.1429M NaOH、1%酚酞试剂、斐林试剂甲、乙液、0.01%标准葡萄糖溶液。（2）实验流程保藏菌株活化菌株（斜面培养）200mL三角瓶麸曲培养500-1000mL三角瓶液体发酵。（3）斜面培养基马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g切成小块，加水约500Ml，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g,琼脂20g,溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。于121灭菌20min，取出摆成斜面备用。麦芽汁琼脂培养基：2/3大麦芽和1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉：水=1：4比例加水，置60下糖化4h至碘液显无色，然后离心15min，获得麦芽汁，调整浓度5Bx，添加20g/L琼脂，分装于经干热灭菌后带棉塞试管内。于121灭菌15-20min，取出摆成斜面备用。一级种子（麸曲种子）培养基 A 含麸皮的查氏培养基（g/L）：蔗糖30、KNO3 1.0、K2HPO4 1.0、MgSO47H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4 7H2O 0.01；调节pH 7.07.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，搅拌至无干粉又无结团，分装入8-10个500mL三角瓶中，塞入8层纱布并包扎好。于121灭菌30min，趁热摇散，冷却至35备用。B麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子去细粉，按麸皮：水=1：（1.1-1.3）比例加水，拌匀至无干粉又无面团，或用水洗麸皮表面，挤至有水感而滴水为宜。上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装20g湿料，塞入8层纱布并包扎好。于121灭菌30min，趁热摇散，冷却至35备用。摇瓶发酵培养基：方案1 取细度为40目以上的薯干粉6-8g，装入500mL三角瓶中，再加入100mL水和中温-淀粉酶（5u/g甘薯粉），于75-80下液化15min，瓶口塞有8层纱布包扎好，于121灭菌20min，趁热摇散，冷却至35备用。方案2 取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中，加入1000mL水和耐高温的- 淀粉酶1020 U/ g 玉米粉，加热至85 ,保温30 min , 碘液不变色后, 继续加热至100 煮沸5 min ,趁热经过两层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15-20%和蛋白质含量不超过4g/L,取过滤清液40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞有8层纱布包扎好，于121灭菌20min，趁热摇散，冷却至35备用。