蛋白质纯化实验指导书.doc

电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大肠杆菌感受态菌制备（CaCl2法） 4 质粒提取 5实验二、IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化 9 实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测 17实验二 IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化一、实验目的1. 掌握重组蛋白体外表达的方法及原理，了解不同表达体系的各自特点;2. 掌握蛋白质纯化技术及原理。二、实验原理 卤醇脱卤酶是一类催化短链脂肪族邻卤醇化合物水解的酶，可以将卤醇底物转变为相应的环氧化物和卤离子。而这些被水解的卤素化合物大部分是应用于工业上的碳氢化合物被卤化而形成的环境污染物。因此，卤醇脱卤酶越来越受到研究者的重视。为了进一步研究卤醇脱卤酶的性质，我们将重组的卤醇脱卤酶HheC质粒转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行原核表达，经IPTG诱导进行重组蛋白体外表达。（一）IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达pGEF质粒是由pET和pGEM以及pBR322质粒的不同部分拼接得到。其全长约有4936bp左右，结构简单，含有一个Amp的抗性标记，和T7的高表达效率启动子。这种启动子不能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因此当宿主缺乏T7RNA聚合酶时，重组质粒中的外源基因片段是不能表达的。为了使外源基因表达，重组质粒必须转入携带有T7RNA聚合酶的宿主大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中。这种宿主菌的RNA聚合酶基因位于lacUV5启动子下游，受其调控。在没有诱导物时，阻遏物与lacUV5启动子结合，阻止RNA聚合酶转录；在添加了乳糖或乳糖类似物IPTG时，阻遏物与诱导物结合，解除了对lacUV5启动子的阻遏，RNA聚合酶得以表达并与T7启动子结合，从而启动了外源基因的转录和翻译。这种结构使pGEFHhes可以稳定的存在于宿主细胞中, 重组蛋白质在IPTG诱导下便可以高效表达。目的蛋白可以通过硫酸铵沉淀和离子交换层析技术与细胞中其他杂蛋白分离开来。（二）离子交换层析将阴离子交换树脂（本身带正电荷）颗粒填充在层析管内，当带负电荷的蛋白质(pHpI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。然后再用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白质一般不引起蛋白质变性，故常用于分离各种天然蛋白质。（三）凝胶过滤层析也称为凝胶层析(Gel chromatography)、排阻层析(eclusion chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatography)。其分离分离机制是按分子大小不同进行分离的一种方法。在分离过程中，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，且在凝胶中经过的路程长，因而最后流出；而大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在凝胶中经过的路程短，在颗粒之间迅速通过，因而最先出峰。10 mM Tris/SO4 buffer (pH 7.5) containing 1 mM b-mercaptoethanol and 100 mM NaCl.三、实验仪器和试剂1锥形瓶，烧杯，试管，恒温摇床，层析柱，超生破碎仪，铁架台，离心机，玻璃棒， 比色杯，分光光度计。2试剂1) LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl10g溶于950ml双蒸水中，用10mol/LNaOH调pH至7，补双蒸水至1000ml，高压湿热灭菌30分钟，然后4保存备用。2) LB固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每100ml加入1.5g琼脂粉，高压湿热灭菌30分钟，当温度降至45-50，无菌操作加入Amp至终浓度100mg/ml。迅速倒入已灭菌的平皿，制成Amp平板。普通平板不加Amp，直接倒平板，凝固后用保鲜膜封好，4保存备用。3) IPTG溶液：1g的IPTG溶于10ml双蒸水中，过滤除菌，分装在10个1.5ml的离心管中。-20闭光保存备用。4) 抗生素溶液：氨卞青霉素（以下均简写为Amp）购自Sigma公司，以无菌双蒸水配制成100mg/ml的储液，过滤除菌，-20保存。5) 平衡缓冲液A（pH7.5）：Tris碱1.21g，巯基乙醇70l，甘油100ml，硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。6) 洗脱缓冲液B（pH7.5）：Tris碱1.21g，巯基乙醇70l，甘油100ml，硫酸氨59.4g，硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。7) SephadexG-100型凝胶。四、实验操作1重组蛋白的高效诱导表达1) 将平皿(含Amp)生长的含有目的基因的pGEFHheC转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)菌株，挑取阳性克隆。2) 接入3ml含Amp（100g/ml）的LB培养基，37，180-200rpm震荡培养至OD600为0.4左右。3) 取300l菌液转入250ml含Amp（100g/ml）的LB培养基中，20，180-200rpm过夜培养16小时至OD600为1.0左右。4) 加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为0.4mM，进行诱导3小时。5) 4000g离心15分钟收集上述诱导的菌液，弃上清。加入等体积的10 mM Tris-SO4重新悬浮菌体，重复步骤5）1次。6) 沉淀重悬于5-10ml平衡缓冲液A中，轻轻摇动使菌体悬浮。7) 用超声破碎仪冰浴破碎菌液，30%振幅破碎8秒，暂停6秒，连续超声15-30个循环，至溶液较清亮为止。8) 10000g离心40分，收集上清（粗提液）。2Q-Sepharose阴离子交换层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）1) 装柱：（自己完善） 2) 上样: （自己完善）3) 洗脱:采用阶段洗脱法。可以采用10%，20%， 30%， 40%，50% 缓冲液B进行洗脱并收集组分（每管2-5ml）。并通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。3凝胶过滤层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）1) 凝胶的处理：将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异，为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。2) 装柱：（自己完善）3) 加样：（自己完善）4) 洗脱：通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。5) 通过SDS-PAGE方式判断卤醇脱卤酶的纯度，并判断分子量。6) 重装:一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3-4倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需将混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。4蛋白浓缩 (选作)经纯化后收集的蛋白需经过蛋白浓缩以提高蛋白浓度。具体方法如下：1) 浓缩柱的清洗：用20%乙醇清洗，再用20ml双蒸水清洗。2) 4000g离心30分钟，除去浓缩柱的双蒸水。弃去收集管中的废液。3) 取20ml收集的蛋白溶液于浓缩柱中。4) 4000g冷冻离心约30分钟。5) 取出残留在浓缩柱的蛋白溶液，保存在灭菌的1.5ml的离心管中。注意：离心时浓缩柱的滤膜要与离心机轴心垂直。浓缩终体积在200-500l之间时停止离心，取出浓缩后的蛋白时，移液枪要贴在浓缩柱的侧壁，以免枪头碰到滤膜使滤膜受到损害。蛋白浓度可提高40倍以上。重点内容：装柱，纯化及蛋白纯化图表制作！五、思考题1. 选择大肠杆菌作为原核表达宿主菌的主要原因是什么？2. 那些因素影响外源基因在宿主中的高效表达？3. 原核表达载体应包含哪些元件？4. 如何避免表达蛋白的被选择性降解以及包含体的形成？实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测一、实验目的1掌握蛋白质分子量测定常用技术：Bradford蛋白浓度测定法；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2掌握卤醇脱卤酶酶活力的测定方法及原理。二、实验原理（一）Bradford蛋白浓度测定法原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000 g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和分子量测定。SDS-PAGE是在要进行电泳分析的样品中加入含阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）和-巯基乙醇的样品处理液，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二、三级结构；b-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，置沸水浴中煮沸35 min，使SDS与蛋白质充分结合，引起蛋白质变性、解聚、带上大量同种负电荷、形成棒状结构。制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，一般分离大分子量蛋白质需要使用较低浓度的分离胶；分离小分子量蛋白质需要使用较高浓度的分离胶。样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快，这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质SDS复合物，甘氨酸和Cl的界面很快超过蛋白质SDS复合物。这时蛋白质SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。（三）卤醇脱卤酶酶活测定原理比色法：卤醇脱卤酶催化邻卤醇转化为相应的环氧化物时，会有卤离子的释放。卤离子，如氯离子或溴离子与Hg2+的相互作用使得Hg2+与SCN-分离，后者与Fe3+生成有色复合物，该物质在1小时内稳定，且可通过在460nm吸收值来确定。三、实验仪器和试剂1电子分析天平（万分之一，千分之一），分光光度计，台式高速离心机，稳压稳流电泳仪，电泳槽，真空泵，微量注射器。2试剂1) 牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为1 000gmL的原液。2) 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容到1 000 mL。此溶液在常温下可放置一个月。3) 乙醇4) 磷酸（85）5) 蛋白质加样缓冲液的配制：40ml: 包含2.5mlTris-Hcl PH6.8，8ml 10%SDS，4ml 100%甘油（或50%甘油8ml），0.8ml 100%-巯基乙醇，最后，加入少许溴酚兰，定容至40ml。6) 浓缩胶和分离胶的制备： 聚丙烯酰胺凝胶组成： 浓缩胶（3%） 分离胶（10%） 40%丙烯酰胺（ml） 0.375 2.5 2%甲叉双丙烯酰胺（ml） 0.2 0.52 Resolving gel缓冲液（ml） 0 1 Staching gel缓冲液（ml） 0.62 0 10%SDS(W/V) （ml） 0.04 0 H2O（ml） 3.7 5.9 10%APS(W/V) （ml） 0.05 0.09TEMED（L） 4.2 5总体积ml 10 57) 染色液1000ml: 包含1g考马斯亮蓝R-250，蒸馏水650ml，异丙醇250ml，冰醋酸100 ml。8) 脱色液1000 ml：包含650ml蒸馏水，异丙醇250 ml，冰醋酸100 ml。9) 固定液1000ml: 包含蒸馏水900ml和冰醋酸100 ml。10) 酶活测定缓冲溶液50mM Tris-SO4：6.05g Tris碱溶于800ml去离子水，稀硫酸定pH至7.5，体积定为1000ml。四、实验步骤1卤醇脱卤酶蛋白质浓度的测定方法一：Bradford 考马斯亮蓝染液配制：在1 L烧杯中加入下列组分成分所需的量考马斯亮蓝G-250100 mg95%乙醇50 ml85%磷酸100 ml注：将溶液定容到1 L，用保鲜膜密封后用磁力搅拌器过夜搅拌，用滤纸过滤，棕色瓶4避光保存。标准蛋白质溶液配制：称取10 mg牛血清蛋白BSA于1 ml 10 mM Tris-SO4中，配成10 mg/ml BSA溶液，在分别取10 mg/ml BSA 溶液稀释，如下表：10 mg/ml BSA(ml)20406080100ddH2O(ml)980960940920900Conc.BSA (mg/ml)0.20.40.60.81.0实验操作：1.用10 mM Tris-SO4做空白，在595 nm吸收波长下校零；2.将配制好的BSA标准蛋白溶液按照1 ml染液，20 l蛋白溶液比例，混匀后于分光光度计中读数，将数据拟合成标准曲线；3.将未知蛋白浓度的蛋白溶液适当稀释，保证其吸收值处于标准曲线有效范围内的情况下，按照1 ml染液，20 l蛋白溶液比例，混匀后于分光光度计中读数；4.根据标准曲线的方程，计算可得出未知蛋白的浓度。A280紫外分光光度法：（选作）测定纯蛋白质在280的吸收值，蛋白质的消光系数可通过软件Dnastar获得，然后根据朗伯比尔定律，由公式c=nA/l，（c为蛋白质浓度（mg/ml），n为稀释倍数，A为280吸收值，为消光系数，l为光路长（通常为1cm），可得蛋白质的浓度。注意事项：1、Bradford方法，考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。可以用于测定混合蛋白样品的蛋白浓度2、280nm方法，蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，其消光系数不一致，所以较适合纯度较高的蛋白质浓度的测定。2SDS-PAGE分析1) 取菌体，在EP管中加入450ulTris-SO4定至0.5ml，保存于冰上，在冰浴条件下，进行朝声破碎：破碎强度21%的功率，破碎6次，每次破碎间隔6s，每次破碎6s；（破碎时应注意：控制破碎时的温度，以避免蛋白质的变性）2) 破碎后，进行离心，转速为13000rpm，15min；3) 取上清液加入2SDS可溶性蛋白提取液（按1：1的比例加入）；4) 将上述混合液沸煮2min；5) 点样，20l（注：上样时最好上相同体积的样品若有空的上样槽应在里面加入等体积的裂菌液）；6) 电泳，100V电压进行电泳，待指示剂进入分离胶后电压调至150V，当溴酚蓝跑出分离胶时电泳结束；7) 下胶，将浓缩胶切下，浓缩胶放入培养皿中；8) 染色，将配好的染色液R-250加入到培养皿中，没过胶；放入到微波炉中，高火加热20s；然后放在摇床上染色45min；9) 脱色，将染色液用漏斗过滤回收染色液；用清水洗掉培养皿中的染色液（2-3次，每次5-6分钟）；加入脱色液，没过胶，放在脱色摇床上，脱色过夜。（注：应适时的更换脱色液以便提高脱色的效果）。先配制分离胶，灌好胶后，用无水乙醇将胶压平，待其