高效液相色谱法测定保加利亚乳杆菌胞内AcetylCoA.doc

高效液相色谱法（HPLC）测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA摘 要：建立了一种快速测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的HPLC分析方法。以C18（Hypersil ODS2 5m）色谱柱为固定相，以缓冲液A（0.2mol/L磷酸钠，pH=5）和缓冲液B（800mL 0.25mol/L磷酸钠，pH=5和200mL乙腈的混合物）为流动相，梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温25，采用紫外检测器（254nm）进行检测。结果表明：该方法可以在17min内实现Acetyl-CoA与其他物质完全分离和定量，Acetyl-CoA在0.0110.359mol/mL范围内的线性关系良好，回归方程线性相关系数R2=0.9995，检出限（以信噪比（S/N）为3计）为0.28mg/L，定量限（以S/N为10计）为0.32mg/L。该方法用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的测定，相对标准偏差（n=6）为0.75%，重现性良好，三个水平的加标回收率为94.8%103.3%，该方法适用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA快速、高效分离和定量。关键词：高效液相色谱，保加利亚乳杆菌，Acetyl-CoADetermination of intracellular Acetyl-CoA in L.bulgaricus by HPLCAbstract：A high performance liquid chromatographic （ HPLC ） method for the determination of Acetyl -CoAin Lactobacillus bulgaricus was developed . The stationary phase used were C18（ Hypersil ODS2 5m ）chromatographic column and the two mobile-phase solvents used were buffer A（0.2mol/L sodium phosphate，pH5） and buffer B （800mL of 0.25mol/L sodium phosphate mixed with 200mL pH5 of acetonitrile ），gradientelution and at a flow rate of 1mL/min，temperature of column at 25，the UV detector was employed to monitorcolumn effluent at 254nm . Results indicated that ： Acetyl - CoA and other substances were completelyseparated and determined in 17min ，the linear correlation coefficients were above 0.9995 in the range of0.011 0.359mol/mL. The limit of detection of acetyl coenzyme A was 0.28mg/L，the limit of quantitation ofacetyl coenzyme A was 0.32mg/L. Under these optimized conditions ，the recovery of the Acetyl -CoA inLactobacillus bulgaricus at three spiked levels were in the range of 94.8%103.3% with the relative standarddeviations（n=6） of 0.75%. This method was fast and accurate for the quantitative analysis of the Acetyl-CoA inLactobacillus bulgaricus.Key words：high performance liquid chromatography（HPLC）；Lactobacillus bulgaricus；Acetyl-CoA中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2013）22-0058-05收稿日期：20130604 * 通讯联系人作者简介：李培照（1986-），男，硕士研究生，研究方向：乳酸菌代谢。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题（20122325120022）；国家自然科学基金项目（31201397）。保加利亚乳杆菌与人类生活关系密切，无论在食品发酵，还是工业乳酸发酵以及医疗保健领域，都被广泛应用，其中最重要的是在牛乳发酵剂方面的应用1-2。这些应用都与保加利亚乳杆菌的代谢有直接关系，乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）是三大营养物质糖、脂肪、蛋白质代谢的枢纽物质，是代谢途径中的一种重要辅因子，参与微生物中上百个中间代谢反应3，如：脂肪酸的合成与分解、氨基酸代谢、生酮作用、甾醇合成和萜类代谢4-6，它是代谢中所有大分子的“接受、装运部门”，并且调控代谢中一些关键酶7。在保加利亚乳杆菌中Acetyl-CoA主要有三大去向：转化成乙醛（一种重要风味物质）、转化成丙二酰辅酶A，进入脂肪酸合成途径以及转化成乙酰乙酰辅酶A，进入甲羟戊酸途径。这三大途径在保加利亚乳杆菌的生理性能方面各自发挥着重要作用。例如，当保加利亚乳杆菌处在恶劣环境下时，可通过提升胞内Acetyl-CoA的含量，调节脂肪酸合成途径来改变细胞膜构成成分及流动性以抵抗不利因素，维持生存。因此，Acetyl-CoA的定量对这三大途径碳流量分配的研究有重要作用，可以通过调节不同途径的代谢通量来满足所需，而胞内Acetyl-CoA的定量是其研究的前体。综上所述，建立一种快速、高效定量Acetyl-CoA58分 析 检 测2013年第22期Vol . 34 , No . 22 , 2013的方法对物质代谢的研究有一定的意义。先前报道的短链酰基辅酶A检测方法包括放射性底物酶反应8-10和紫外检测的毛细管电泳11。这些方法的灵敏度、样本检测含量和动力学范围有一定的限制。有报道用气质联用可以灵敏检测乙酰辅酶A12-14，但此方法稍显繁琐，要求乙酰辅酶A水解及衍生等，可能会影响定量测定的准确性。目前，国内有利用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对植物组织中的Acetyl-COA定量的报道15，HPLC测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA国内少有报道，本研究的目的是建立一种快速、准确定量乳酸菌胞内Acetyl-CoA的高效液相色谱法，为乳酸菌胞内Acetyl-CoA代谢的研究提供技术支持。1 材料与方法1.1 材料与仪器乙腈 色谱纯，超纯水（电阻率为18.2M）；二硫苏 糖 醇 Amresco 公 司 ；Acetyl -CoA 钠 盐（CAS102029-73-2） Sigma公司；其他试剂 分析纯；菌种 德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC 11842；MRS培养基 葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、MgSO47H2O 0.58g、MnSO44H2O 0.25g、吐温-80 1mL，加入1L蒸馏水充分溶解后，调pH6.20.2，1105Pa，灭菌15min备用。高效液相色谱仪 美国Waters2695高效液相色谱系统，配备真空脱气机、四元泵、2487紫外检测器；GL-21M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所；SYNERGY 超纯水仪 美国 Millipore 公司；KQ -800GKDV高功率恒温数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。1.2 实验方法1.2.1 样品处理与测定 参照Vadali RV等16的方法略做改动。150mL发酵液以8000r/min、4离心10min，20mL PBS缓冲液洗涤两次，5mL PBS悬浮沉淀，立即放入液氮中冷冻3min，37水浴，冻融重复两次（利于后续破壁）。以8000r/min、4离心10min，弃上清液。加入2mL含有2mmol/L二硫苏糖醇的6%的高氯酸溶液，促进细胞溶解，此混合物超声波处理15min，以12000r/min、4离心10min除去细胞碎片及变性蛋白。上清液转移到预冷的10mL离心管中，逐滴加入3mol/L K2CO4溶液（添加的过程中漩涡振荡使其充分混匀）调pH为3，以12000r/min、4离心10min除去KClO4晶体。上清液转移到EP管中，0.22m针头式过滤器过滤，-20贮存，用于HPLC。1.2.2色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2（C18）柱5m，4.6mm250mm（大连依利特），流动相：缓冲液A（0.2mol/L磷酸钠，pH5.0）和缓冲液B（800mL 0.25mol/L磷酸钠，pH5.0和200mL乙腈）。梯度洗脱，流速1mL/min，柱温25，紫外检测波长254nm，进样量10L。1.2.3 标准溶液配制与曲线绘制 精确称取一定量的Acetyl-CoA钠盐于10mL容量瓶里，超纯水溶解并定容，使终浓度为0.359mol/mL作为标品储备液，若不立即使用，-20贮存（一周左右有效）。精密吸取储备液依次稀释2、4、8、16、32倍，以峰面积为纵坐标，Acetyl-CoA的摩尔浓度为横坐标做标准曲线，求出直线回归方程。1.2.4定性与定量 在相同条件下，将样品色谱图与标准品色谱图对照，根据保留时间确定样品中目标峰，在标准品与样品进样量相同的条件下，应用外标法定量，计算样品中Acetyl-CoA的含量。2 结果及分析2.1 标准物质的确定在1.2.1 色谱条件下测定 Acetyl-CoA 标准溶液（图1），确定 Acetyl-CoA 的保留时间为 16.515min。Acetyl - CoA 的标准曲线见图 2 ，线性回归方程为y =6 106x -12914，R2=0.9995，Acetyl -CoA 在 0.011 0.359mol/mL范围内的线性关系良好。2.2 液相色谱条件的选择2.2.1 流动相的选择 磷酸盐缓冲液是反相色谱柱上应用较广的流动相，本实验选择磷酸钠和磷酸钾溶液作为流动相比较分离情况。结果表明，这两种缓冲液都可以很好地分离Acetyl-CoA，但在相同浓度下，磷酸钠为流动相时，样品中Acetyl-CoA的响应更大，因此选择磷酸钠为流动相。考虑到一般色谱柱要求，使用的流动相pH范围2pH9，Acetyl-CoA又是CoA的乙酰化形式，可以看作是活化了的乙酸，为保障其稳定性，本实验分别配制pH为3、4、5、6的磷酸钠缓冲溶液。结果表明，pH的变化对样品中辅酶A（CoA）、Acetyl-CoA、乙酰乙酰辅酶A（Acetoacetyl-CoA）、丁酰辅酶A（Butyryl-CoA）及CoA其他短链衍生物的分离有较大的影响，pH为5图1 Acetyl-CoA标准品HPLC分离色谱图Fig.1 HPL C chromatogram of Acetyl-CoA standardAU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.2080.060.040.020.00时间（min）16.515图2 Acetyl-CoA标准曲线Fig.2 The standard curve of Acetyl-CoA峰面积（mAus，105）0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.402520151050mol/mL59Science and Technology of Food Industry分 析 检 测2013年第22期时分离效果较好（见图3），因此本实验选用pH为5的缓冲液为流动相。2.2.2柱温的选择 本实验选取25和30两个温度对比进行温度的选择，结果显示，这两个温度对Acetyl-CoA的分离效果无明显影响，温度越高，对色谱柱的损害越大，考虑到对色谱柱寿命的延长，选取25作为分离Acetyl-CoA的温度。2.2.3流速的选择 设置柱温为25，分析流动相流速为0.8、1.0、1.2mL/min时对Acetyl-CoA分离效果的影响（见图4）。结果显示，流速直接影响Acetyl-CoA的分离时间，随流速的增加，Acetyl-CoA保留时间会缩短，但流速越高柱压就越高。当流速为1.0mL/min时，Acetyl-CoA在17min内完成分离且柱压适宜，故流速选为1.0mL/min。2.2.4 梯度洗脱条件的确定 由于采用等度洗脱难于将Acetyl-CoA与其他物质分离，本实验采用梯度洗脱。实验中考察了流动相中乙腈的比例对Acetyl-CoA分离度、灵敏度和色谱峰形的影响。经多次实验，梯度洗脱程序见表1，样品分离色谱图见图5。2.2.5检出限和定量限 检出限和定量限的确定是根据流动相中样品组分在检测器上峰高与噪音峰高的比值（即S/N）来确定的。在空白样品中加入较低浓图3 不同pH条件下样品色谱图Fig.3 Chromatogram of sample under different pH注：1-CoA；2-Acetoacetyl-CoA；3-Acetyl-CoA；4 -Butyryl-CoA。AU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）A2BCD134pH=3AU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）2134pH=4AU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）2134pH=5AU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）2134pH=6图4 不同流速条件下Acetyl-CoA保留时间Fig.4 Retention time of Acetyl-CoA under different flow rateABCAU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）Acetyl-CoA0.8mL/minAU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）1.0mL/minAU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）1.2mL/minAcetyl-CoAAcetyl-CoA时间（min） 缓冲液A（%） 缓冲液B（%）0.00 97 35.00 82 187.50 72 2812.50 60 4018.00 58 4220.00 97 3表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program60分 析 检 测2013年第22期Vol . 34 , No . 22 , 2013图5 样品分离HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of sampleAU2.00 6.00 10.00 14.00 18.000.0900.0800.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100.000时间（min）Acetyl-CoA度的标准样品，稀释成一系列浓度梯度进行测定，以S/N为3和10时对应的标准溶液浓度来分别确定检出限和定量限。通过系列浓度获得符合一定数值S/N对应的浓度，准确配制该浓度标准样品来再次确定。检出限和定量限分别为0.28mg/L和0.32mg/L。2.2.6 精密度、重复性和回收率 以保加利亚乳杆菌培养至对数末期（16h）的菌体为样品，用本方法对其进行六次重复测定，其峰面积与Acetyl-CoA的浓度见表2。由表2的分析结果可知变异系数较小，本方法的精密度高（5%），具有良好的重现性。已知浓度的Acetyl-CoA同一样品平行取样3次，进行3个水平的加标回收实验，结果见表3，此方法测定Acetyl-CoA含量的加标回收率在94.8%103.3%。2.3 样品的测定结果用此方法对培养16h（对照组）及培养至14h加2% NaCl刺激2h（处理组）的保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA进行了分离与定量。结果显示，对照组胞内Acetyl-CoA的含量为5.17710-5mol/mg（占菌体湿重的比例），处理组胞内Acetyl-CoA的含量为6.84510-5mol/mg，处理组胞内Acetyl-CoA的含量相对于对照组增加了32.22%。3 结论采用Hypersil ODS2（C18）柱建立了对保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA定性与定量的HPLC分析方法，方法的线性范围及分析结果的精密度、重现性和回收率均能满足胞内Acetyl-CoA的检测。实验表明，本方法具有前期处理简单，避免了气质联用检测胞内Acetyl-CoA前期的水解和衍生等繁琐程序；分析速度快，在17min内便可实现乳酸菌胞内Acetyl-CoA与其他物质的完全分离，能及时测出其变化；灵敏度高，克服了放射性底物酶反应和紫外检测毛细管电泳等方法检测Acetyl-CoA的缺陷。本方法所用设备在实验室较为常见，操作也较为方便，对Acetyl-CoA的代谢研究具有一定意义。参考文献1 Chammas，Saliba R. 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Separation andQuantitation of Short-Chain Coenzyme As in Biological Samples分析次数（n=6） Acetyl-CoA含量（mol/mL）1 0.02682 0.02673 0.02674 0.02725 0.02676 0.0267平均值 0.0268标准偏差 0.0002相对标准偏差（%） 0.75表2 重复性实验结果Table 2 Repeated experiment results序号样品中Acetyl-CoA含量（mol/mL）加入Acetyl-CoA含量（mol/mL）实测值（mol/mL）回收率（%）1 0.0267 0.0130 0.0395 98.462 0.0267 0.0260 0.0513 94.83 0.0267 0.0520 0.0804 103.3表3 样品加标回收率Table 3 The recovery of spiked sample（下转第65页）61分 析 检 测2013年第22期Vol . 34 , No . 22 , 2013by Capillary ElectrophoresisJ. Anal Chem，2003，75（1）：78-82.12 Wolf A，Wendy Conrad-Kessel，John Turk. Long-chainfatty alcohol quantitation in subfemtomole amounts by gaschromatography - negative ion chemical ionization massspectrometry ：Application to long - chain acyl coenzyme Ameasurement J. Journal of Chromatography A，1990，509（2）：325-332.13 Takhar Kasumov ， Wenjun Z Martini . 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Metabolic Engineering ，2004，6（2）：133-139.线性判别法（linear discrimination analysis，简称LDA）是研究样品所属类型的一种统计分析方法。LDA分析利用了电子鼻所有传感器的信号以提高其分类的准确性，更加注重采集的梨醋香气成分响应值在空间的分布状态及彼此之间的距离分析。从图6中可以发现，按照线性判别分析方法，第一主成分区分贡献率为99.26%，第二主成分区分贡献率为0.05%。第一、第二主成分总的区分贡献率达99.31%，因而雪梨醋和鸭梨醋的区分是非常明显的。3 结论本实验采用电子鼻分析了雪梨醋和鸭梨醋香气成分。结果表明，二者的特征性香气成分类似，但雪梨醋要比鸭梨醋的芳香味略浓郁一些。确定了硫化物、有机芳香硫化物、氮氧化合物、甲烷类、醇类、芳香成分苯类和烷烃类传感器作为雪梨醋和鸭梨醋电子鼻的传感器阵列，在雪梨醋和鸭梨醋香气评价起主要作用。采用电子鼻系统中的主成分分析法以及线性判别法对原始数据进行分析，发现这两种分析方法均能准确区分出雪梨醋和鸭梨醋。Loadings分析表明7号传感器对梨醋第一、二主成分的区分贡献率均最大。在此基础上，可对不同酿酒酵母、醋酸菌及发酵条件所生产的梨醋进行香气分析，以优化梨醋酿造工艺和品质监控。参考文献1 霍川，刘青青. 我国果醋的研究现状与发展前景J. 安徽农业科学，2012，40（29）：14470-14472.2 彭帮柱，岳田利，袁亚宏，等 气相色谱质谱联用法分析苹果酒香气成分的研究J 西北农林科技大学学报：自然科学版，2006，34（1）：71-74.3 Ubeda C，Callejn RM，Hidalgo C，et al. Determination ofmajor volatile compounds during the production of fruit vinegarsby static headspace gas chromatography mass spectrometry methodJ. 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