灰霉AUR1基因的必需性分析.ppt

灰霉AUR1基因的必需性分析,黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建,以黑曲霉基因组 D N A为模板，用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1.4kb和下游约1.3kb两段DNA序列，将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5和3端， 构建成重组质粒pMW1pepB，用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。,1、P CR引物设计和扩增反应,根据pepB全基因序列设计两对引物 P1/P2和T1/ T2。 在P1和P2中分别引入限制性酶切位点Hpa1和Sal 1，T1和 T2 中分别引入限制性酶切位点BamH 1和 Hpa1。以黑曲霉染色体DNA为模板，使用上述两对引物分别 PCR扩增pepB基因中的上游(以后简称为P端)序列与下游(以后简称为T端 )序列。,pepB基因阻断质粒的构建,PCR产物P端先用T4DNA聚合酶削平，再用Sal1酶切,载体pMW1先用HindIII酶切，Klenow补平后再用Sal1酶切。将处理后的P端克隆到上述载体，得到pMW1-P。 PCR产物 T端同样用T4DNA聚合酶削平，克隆到pMW1-P的Sma I位点。获得含pepB阻断基因的pMW1-pepB (图1) ，分别用Pst1和EcoR1，Sal 1和BamH 1双酶切，Hpa 1单酶切，均获得与预期相同的酶切片段，证明构建正确。,pepB基因阻断质粒的结构示意图,黑曲霉pepB基因缺失株的筛选及PCR检测,为了通过同源重组构建pepB基因缺失株，以Hpa 1酶切Pmw1-pepB阻断质粒 ，产生4.2kb的线性片段，该片段由pepB基因的 P端和T端同源序列片段和插入其间的选择标记 hph组成。进而通过原生质体-PEG 转化方法将该片段导入黑曲霉 在Hgy平板上筛选hph转化子。以转化子基因组DNA为模板，用引物对Phph /PT-out和 P3/T3进行P CR检测。,如果 4.2kb的线性片段与受体染色体DNA发生同源重组，pep B基因在 P端同源序列 和 T端同源 序列之间的203bp染色体DNA将被hph表达单元 取代。则以Phph /PT-out为引物的 P C R， 将得到大小约 为1.3 kb的特异片段;而以P3/T 为引物的PCR检测，将得到大小约 为 1.8 k b的片段 ( 图 2 ) 。 如果 4.2 k b线性转化片段随机插入染色体基因组，则pepB基因没有被破坏，以Phph /PT-out 引物对各转化子进行 PCR检测时就不会有1.3 k b特异片段出现或无PCR扩增产物； 而以P3/T3引物对各转化子进行PCR检测时，将得到516 bp的特异性片段，与出发株相同。,PCR引物设计和扩增反应,根据 AUR1全基因序列设计两对引物 P1P2和 T1T2： P1: CGACCACATATCTGGGTT P2: TACGGTACCAGTATT Kpn I T1: CGAATCGATTTACTA Cla I T2: GGACCATGGGATCGT,以灰霉染色体DNA为模板，使用上述两对引物分别PCR扩增AUR1基因中的上游 ( 以后简称为 P端 ) 序列与下游( 以后简称为 T端 ) 序列。 其中Kpn I和Cla I为质粒pTFCM上的单一酶切位点，而在灰霉AUR1中也含有这两个酶切位点。 将扩增片段插入到质粒pTFCM的潮霉素抗性表达框的两端，即构建出AUR1基因的缺失载体。,同源重组转化子的检测,以转化子基因组 D N A为模板，用引物 Phyg ： PT-out ： 进行PCR检测。如果发生