实验5_重组质粒dna提取及双酶切鉴定课件

1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒,实验五,实验目的,掌握质粒提纯的原理和方法; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶.,预习：基因克隆示意图,基因克隆操作过程：,基因载体（gene vector）,什么是基因载体 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具 基因载体的作用 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件,基因载体应具备特点,1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增 2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达能力） 3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）,6,基因载体类型,质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC）,7,一.质粒DNA的制备,1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？,8,(1)质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形式存在。,9, 超螺旋DNA(SC DNA),(2)质粒的三种构型,10, 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。,11, 线状DNA(linear DNA,L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？）,12,(3)质粒DNA的一般特性： 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。,13,(4)提取质粒DNA的目的与意义（？） 基因载体/基因克隆/基因工程,2 提取质粒DNA的常规方法: 2.1 核酸分离纯化的总原则： 保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）,2.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤,培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） 细菌的收集与裂解 收集高速离心的方法 质粒DNA的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。,3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA 3.1 实验原理： 在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA断裂成不同长度的双链DNA。,16,强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离； 当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。,17,如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。,18,3.2 主要试剂及作用,溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）,19,溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）,20,溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) HAC溶液能中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。,实 验步骤及注意事项,加1.4ml培养物于EP管，12000rpm30S 除去上清，再取1.4ml离心30s 除去上清，加入冰的100 l溶液I，颠倒EP管，混匀 加入200l溶液II，温和混匀，冰浴35min 加入150l冰溶液III，温和混匀，冰浴35min，12000rpm5min 转移上清到新EP管，加入等体积酚和氯仿/异戊醇，12000rpm5min 转移上清到新EP管，加入等体积氯仿/异戊醇，12000rpm5min 上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 冰箱中放置20min，120005min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室温静置1015min ， 20 l TE 溶解DNA,注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型（pUC119-U6 ）； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤。,二、限制性内切酶切割重组质粒,1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。,24,作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。,分类 、 （基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,影响限制酶活性的因素,1）“星”活性 酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。 EcoR：GAATTC EcoR*： AATT 2）甲基化 识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 3）底物性状 4）试剂：缓冲系统,pUC18/19酶切位点的分布示意图,2 BamHI 、Hind酶切重组质粒及鉴定,1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）,31,重组质粒,BamHI,Hind III,双酶切,电泳检测,2 实验材料: 重组质粒; BamHI 、Hind 限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。,33,3 实验步骤: A 建立反应体系 B 酶切反应（温育1-3h） C 电泳鉴定,34,4、双酶切体系（0.2mlEP管）： 质粒DNA 10l 10M buffer