蛋白质组分的连续累进提取分析法.doc

我有一个方法叫蛋白质组分的连续累进提取分析法具体内容是：1方法原理 谷物籽粒中的清蛋白可溶于水，球蛋白可溶于盐溶液，醇溶蛋白可溶于乙醇、丙醇等有机溶剂，谷蛋白可溶于碱溶液。因之，可用不同的溶剂来分别提取这四种蛋白质。 2试剂与仪器 氯化钠(分析纯)0.5N，异丙醇(分析纯)50%v/v,氢氧化钾(分析纯)0.1N，浓硫酸(分析纯)，氢氧化钠30%32%，硼酸3 %4%分解促进触媒(4.5g硫酸钾+0.5g硫酸铜)，混合指示剂:0.2%的甲基红，0.1%的亚甲基蓝，1 :1(v/v)混合，标准酸(0.02N硫酸)，石英砂(直径0.51.0mm)。 仪器采用样品磨粉机(筛孔直径0.3mm)，玻璃交换柱，日本VS-KTP自动定氮仪. 3分析方法 样品准备:把清理干净的籽粒在38下风干48h，用样品磨粉机磨制样品，放入干燥器备用。 装交换柱:在交换柱底部过滤筛板上置一层滤纸，称取酸洗并经高温（540C)处理过的石英砂60.00g，样品2.000g装入三角瓶中混合均匀，每个样品重复3次，设空白对照。另外称取20.00g石英砂，将其中10.00g置交换柱底部，将三角瓶中混合物装入柱内，再将剩余的10.00g石英砂加入交换柱上部。 提取过程:在提取前加20m1蒸馏水，排出柱内气体，浸湿样本，然后按下列步骤进行:加100ml蒸馏水，提取清蛋白，定溶于100ml容量瓶中。调节提取液流速为0.5m1/min( 1滴/6秒);加100ml氯化钠溶液(0.5N)提取球蛋白，定溶于100ml容量瓶中，加100m1异丙醇溶液50%)提取醇溶蛋白，定溶于100m1容量瓶中;加100m1氢氧化钾溶液(0.1 N),提取谷蛋白，定溶于100m1容量瓶中。 提取液中蛋白质的测定方法:从每一容量瓶提取液中吸取10mI，放入消解管中，吸取提取液时应摇荡容量瓶，防止沉淀;加3 ml浓硫酸，2.5g分解促进媒，重复3次。用150C预热半小时，蒸干溶剂，防止样品爆沸溢出。然后用200C加热半小时，400加热半小时，用自动定氮仪测定含氮量。 石英砂中残渣蛋白质的测定方法:将交换柱中的石英砂混匀，并称取8.15g其中2g样品中的四种蛋白质组分约为0.5g,剩余残渣约1.5g)将石英砂放入消解管中，加6m1浓硫酸，2.5g分解促进触媒，同上述方法消解;向消解过的管中加入10ml蒸馏水摇荡。将管中溶液倒入另一管中，反复3次，以原管中石英砂无青蓝色为准，洗出液置100C烘箱蒸至管中溶液约为10ml;用自动定氮仪测定时不再稀释，碱液用量应增加一倍蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一 目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二 原理 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三 试剂和器材 试剂：1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液） 3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4暗处贮存，一个月内使用 4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED） 8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g， 溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2样品稀释液： SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油 3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4存放数周，或在-20保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液： 0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四 操作步骤 1分离胶制备： 凝胶浓度 5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水 ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵 ml 0.1 TEMED (L) 20 将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形 成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的加样孔中加入蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的电极缓冲液。 2, 样品制备： 标准蛋白质制备 待测蛋白样品制备： 液体待测样品，可取500L，加入等体积的“2样品稀释液”，混匀，在沸水浴中加热5min, 取出，冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。 3，点样 用微量进样针吸取上述蛋白质样品20L分别加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，每 个样品应做两次重复。 4，电泳 将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，保持恒电压300V，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。 5，固定，染色，脱色 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液23次，震荡达24h以上。 凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。正交实验法编辑词条 正交实验法就是利用排列整齐的表 -正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。大家在关注：目录简介试验方法正交实验法举例展开编辑本段简介正交实验法就是利用排列整齐的表 -正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。编辑本段试验方法我们知道如果有很多的因素变化制约着一个事件的变化，那么为了弄明白哪些因素重要，哪些不重要，什么样的因素搭配会产生极值，必须通过做实验验证(仿真也可以说是实验，只不过试验设备是计算机)，如果因素很多，而且每种因素又有多种变化(专业称法是：水平)，那么实验量会非常的大，显然是不可能每一个实验都做的。能够大幅度减少试验次数而且并不会降低试验可行度的方法就是使用正交试验法。首先需要选择一张和你的实验因素水平相对应的正交表，已经有数学家制好了很多相应的表，你只需找到对应你需要的就可以了。所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的实验方案，他告诉你每次实验时，用那几个水平互相匹配进行实验，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。比如3水平4因素表就只有9行，远小于遍历试验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，试验的精简程度会越高。建立好实验表后，根据表格做实验，然后就是数据处理了。由于试验次数大大减少，使得试验数据处理非常重要。首先可以从所有的实验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的了。这是你能得到一组因素，这是最直观的一组最佳因素。接下来将各个因素当中同水平的实验值加和(注:正交表的一个特点就是每个水平在整个实验中出现的次数是相同的)，就得到了各个水平的实验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的试验。各个因素中不同水平试验值之间也可以进行如极差、方差等计算，可以获知这个因素的敏感度，等等等等，还有很多处理数据的方法。然后再根据统计数据，确定下一步的试验，这次实验的范围就很小了，目的就是确定最终的最优值。当然，如果因素水平很多，这种寻优过程可能不止一次。 在生产和科研中，为了研制新产品，改革生产工艺，寻找优良的生产条件，需要做许多多因素的实验。 在方差分析中对于一个或两个因素的实验，我们可以对不同因素的所有可能的水平组合做实验，这叫做全面实验。当因素较多时，虽然理论上仍可采用前面的方法进行全面实验后再做相应的方差分析，但是在实际中有时会遇到实验次数太多的问题。例如，生产化工产品，需要提高收率（产品的实际产量与理论上投入的最大产量之比），认为反应温度的高低、加碱量的多少、催化剂种类等多种因素，都是造成收率不稳的主要原因。根据以往经验，选择温度的三个水平：80、85、90；加碱量的三个水平：35、48、55（kg）；催化剂的三个水平：甲、乙、丙三种。如果做全面实验，则需333=27次。如果有3个因素，每个因素选取4个实验水平的问题，在每一种组合下只进行一次试验，所有不同水平的组合有444=64种，如果6个因素，5个实验水平，全面实验的次数是555555=15，625次。对于这样一些问题，设计全面的实验往往耗时、费力，往往很难做到。因此，如何设计多因素实验方案，选择合理的实验设计方法，使之既能减少实验次数，又能收到较好的效果。“正交实验法”就是研究与处理多因素实验的一种科学有效的方法。正交实验法在西方发达国家已经得到广泛的应用，对促进经济的发展起到了很好的作用。在我国，正交实验法的理论研究工作已有了很大的进展，在工农业生产中也正在被广泛推广和应用，使这种科学的方法能够为经济发展服务。编辑本段正交实验法举例用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响目的要求1.初步掌握正交实验设计方法的使用2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值实验原理酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（3）的实验方法。正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤：（1）确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。（2）选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。（3）选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有相互独立性。（4）确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择20、30 、50 三个水平。（5）选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。（6）配列因素水平，制定实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。（7）实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。（8）实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。 操作方法1.实验设计：1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活力。这里，用A520值表示。2）制定因素水平表：考察四个因素（温度、pH值、底物浓度和酶浓度），每个因素取三个水平（如温度选择20、35 和50 三个水平）。水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如表1。表1 因素水平表 3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（366）和L27（389）。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的四个因素，故选用L9（34）表，见表2。分析：A. 判断各因素的水平范围是否选偏；B. 判断各因素显著性大小的顺序；C. 判断实验结果的置信度。实验安排具体操作步骤： 1、将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于试管中。2、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10-30ml不等），离心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4。3、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的倍数来确定酶的稀释倍数）A520在0.4-2.0之间即可。4、准备10支试管。其中一支为“0”号管，作为测量时的参比溶液。其他九支试管根据前面的图表3加入相关的溶液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸的方法测定不同管在A520下的光密度值。5、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小，表示该水平为酶反应的最适条件。1）数据记录：将上述两组平行实验的结果取平均值后的9个数据，填入表4中的Yi项内。2）数据整理及分析：对于一般的实验，可用极差分析，该分析方法简单、直观。对要求精细的实验，则要用方差分析，该方法可给出误差的大小估计，但有一定的计算量。对于有混合水平的正交实验，只能用方差分析。本实验，只使用极差分析：A. 计算出各水平实验结果总和，即第1、2、3、4列上的k1、k2、k3，并求出k1、k2、k3和k的R值（极差）。B. 选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的顺序，并比较k值选出优水平组合（即好的实验条件）。由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温度、pH值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值蛋白质的分离方法有哪些？它们各依据蛋白质的什么性质或特点？（一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE=宋体 LANG=ZH-CN纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章） （四）根据配体特异性的分离方法亲和色谱法 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification） 和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 浓缩、干燥及保存 一、样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的： 1、减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。 4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。 5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值： 膜名称分子量截留值孔的大的平均直径 XM300300，000140 XM200100，00055 XM5050，00030 PM30 30，00022 UM2020，00018 PM1010，00015 UM21，00012 UM05500 10 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。 二、干燥 生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。 三、贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持04度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。 1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。 2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也