天然药物提取分离技术实验指导.doc

金华职业技术学院实验教学大纲一、课程名称：天然药物提取分离技术课程性质：必修课，面向专业：生物制药，课程总学时：16学时 二、实验的地位、作用和目的天然药物提取分离技术实验教学是天然药物提取分离技术课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和鉴定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力，养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。三、基本原理及课程简介天然药物提取分离技术实验中选择天然药物中几个具有代表性的成分类型作为研究对象，实验内容包括单体成分的提取、分离、鉴定等过程。通过这些实验使学生继续巩固基本操作技能，灵活应用于其他天然药物成分的分离。学生自己查阅有关文献，对具体的实验内容、条件提出合理建议，培养学生分析问题、解决问题和独立工作的能力。四、实验方式及基本要求带习老师讲述实验原理、流程和注意事项等，由学生每人单独操作完成实验，要求学生以科学的态度和科学的作风进行实验，掌握天然药物生物活性成分的提取、分离纯化及鉴定能力，学习衍生物制备的手段及应用。 五、实验报告实验报告要求学生以原始记录为基础，书面形式详实叙述每次实验的目的、原理、操作过程、现象和结果等，并以讨论的形式如实叙述实验过程中发现的问题、个人的体会、以及实验应注意的问题等。每次实验报告应包含以下内容：实验题目、实验目的、实验原理、实验内容、实验结果、以及讨论。六、考核及考试 本实验以学生的预习报告、原始记录、实验操作、科学作风及实验报告做为考核标准。七、基本设备与器材配置烘箱，磁力搅拌，电热套，电炉，紫外分析仪，旋转蒸发仪，真空泵，红外干燥箱，电子秤，冰柜八、实验项目及内容提要1槐花米中芦丁的提取分离与鉴定a.预试； b.苷的碱提取、酸沉淀； c. 产品的精制； d苷的水解；e.苷、苷元的定性鉴定；f. 糖的纸层析鉴定准备；g.苷的乙酰化物的制备及熔点测定；h.苷、苷元的TLC鉴定；i. 糖的纸层析鉴定2.大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定a.预试； b.氯仿浸提； c. 产品的精制； d蒽醌类化合物的定性鉴定；e.蒽醌化合物的TLC鉴定；h. 蒽醌纸层析鉴定3汉防己生物碱的提取分离与鉴定a.预试；b.酸提取、碱沉淀；c.洗、烘砂80克；d.抽滤提取物，拌砂后烘干；e.铺板；f.萃取亲酯性叔胺总碱，重结晶；g.生物碱的TLC鉴定实验一 槐米中芦丁的提取及鉴定一、概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174178，无水物188190。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。二、实验目的和要求1、实验目的 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。2、要求： 要拿到芦丁化合物。三、实验方法：（1）芦丁的提取与分离（见下图）芦丁的提取与分离流程图（2）芦丁的鉴定 芦丁的定性反应 取芦丁34mg，加乙醇56ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液12ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液12ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液12ml，然后再加入10%-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 芦丁水解后糖与苷元的鉴定 A. 水解方法：精密称取芦丁1g（0.01g），加1%硫酸100ml，加热40min，放冷静置，过滤。所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，计算苷元与糖的重量比。然后用乙醇（95%大约10ml）进行重结晶，即得苷元。B. 苷元的鉴定：用纸色谱法与对照品对照。四、实验指导 1本实验讲解要点及注意事项 芦丁提取方法，重点介绍碱-酸法的原理及注意事项。 定性实验的目的、意义及注意事项。2实验报告要求 碱-酸法提取芦丁的原理 定性反应的反应机理 详细记录定性反应结果 绘制色谱结果模拟图，并计算Rf值3思考题 苷类结构的检识大体程序如何？ 苷类水解有几种催化方法？ 怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3-O-上？ 怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖基一个鼠李糖？ 苷元的结构是怎样确定的？ 怎样确定苷键的构型？ 芦丁的全乙酰化物的制备与苷元乙酰化物（槲皮素）的制备有何不同？为什么？试验二 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定一、概述 大黄记载于神农本草经等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。 自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L），大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：R1R2名 称晶 形熔 点-H-COOH大黄酸(Rhein)黄色针晶318320-CH3-OH大黄素(Emodin)橙色针晶256257-H-CH2OH芦荟大黄素(Aloe-emodin)橙色细针晶206208-CH3-大黄素甲醚(Physcion)砖红色针晶207-H-CH3大黄酚(Chyrsophanol)金色片状结晶196 大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH，酸性最强；大黄素连有-OH，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH3和-CH3，后者只连有-CH3，因而后者酸性排在第四位。二、实验目的和要求 1学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。 2掌握PH梯度法的原理及操作技术。 3通过磷酸氢钙柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚的试验，进一步熟悉柱色谱操作技术。 4学习蒽醌类化合物鉴定方法。三、实验方法 1大黄总蒽醌苷元的提取注意：大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。2总蒽醌苷元分离方案的设计 大黄总蒽醌苷元的纸色谱 蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验 最佳萃取剂及其用量的确定各种萃取剂用量的确定新分离方法的设计蒽醌类成分的分离与精制大黄酸的分离与精制将含有总游离蒽醌的氯仿液450ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8缓冲液275ml振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置250ml烧杯中，加HCl酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。大黄素的分离与精制将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液275ml振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCl酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。芦荟大黄素的分离和精制余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1) 碱水液540ml或用0.5%KOH540ml振摇萃取，碱水液加HCl酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。 大黄酚和大黄素甲醚的分离磷酸氢钙柱色谱蒽醌类成分的鉴定 纸色谱鉴定 IR光谱解析四、实验指导 1本实验讲解要点及注意事项。 PH梯度萃取的原理及注意事项。 如何设计萃取分离方案的程序与方法。 蒽醌化合物红外光谱的特点。 分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCl3，回洗碱水液。 缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。每步萃取时，利用纸色谱检查跟踪萃取效果，如未达到预想效果应及时纠正。2实验报告要求 记录大黄总蒽醌的提取方法。 总蒽醌的纸色谱检查结果（附色谱图）。 总蒽醌的缓冲纸色谱结果，并说明它对总蒽醌分离方案设计有何启示。 记录总蒽醌的分离程序（包括溶剂用量），及各分离物粗品的纸色谱检查结果，与原设计有何出入，原因何在？ 记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及纸色谱。实验三 汉防己生物碱的提取分离与鉴定一、概述汉防己为防己科千金藤属物Stephania tetrandra S. Mcore的根，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱。主要是汉防己甲素和汉防已乙素。临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用，此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。二、实验目的与要求通过汉防己中几种生物碱的提取分离和鉴定，要求掌握下列知识和技能。1 生物碱的一般提取方法。2 用低压柱层析分离，纯化单体的方法及薄层层析鉴定三、已知生物碱的结构和性质汉防已根中总生物碱含量为1.52.3%，主要为汉防已甲素，含量约1%，汉防已乙素，含量约0.5%；轮环藤酚碱，含量为0.2%；以及其它数种微量生物碱。1汉防已甲素（Tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱）无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯，mp 216，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150左右熔后加热又固化，至213复熔。2汉防已乙素（Fangchinoline, 又称防已诺林碱，去甲粉防已碱）溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。籍此可以相互分离，用不同溶剂重结昌时，其晶形和溶点不同：乙醇 细棒状结晶 mp 24540甲醇 细棒状结晶 mp1779丙酮 六面粒状晶 mp134吡啶-甲醇 mp 1212 环已烷-EtocAc mp 1563轮环藤酚碱（Cylanoline）为水溶性季铵生物碱，不溶于极性溶剂，氯化物为无色，八面体状结昌，mp 2146，碘化物为无色绢丝状结晶，mp185；苦味酸盐为黄色结晶，mp1546。四、生物碱的提取分离1总生物碱的提取和亲脂性与亲水性生物碱的分离注一：将汉防已粗粉加适量酸水液，以能将生药粉末润湿为度（约150ml），充分拌匀，放置半小时，均匀而致密地装入渗筒内，用锥形瓶底部或其它平底工具压紧，供渗漉用，流速约1.5ml/分。注二：净砂必须事前洗净烘干，拌和量最好不要超过120g，以免索氏提取器一次装不下或装得过多。提不尽生物碱。注三：检查生物碱是否提尽的方法，是取最后一次乙醚提取液约数滴，挥去乙醚，残渣加5%HCl 0.5ml溶解后，加改良碘化铋钾试剂一滴，无沉淀折出或明显浑浊时，表明生物碱已提尽，或基本提尽。反之，应继续提取。注四：先将提取器内滤纸筒取出。然后将提取玻筒内最后一次乙醚提取液倾出（另器贮存），再将提取玻筒安装好，继续加热，回收烧瓶中乙醚于玻筒中，至烧瓶内的乙醚提取液体积较小时，停止回收，将烧瓶中乙醚提取液倾出。2低压柱层析分离汉防已甲素和乙素低压柱层析在低压下（0.53kg/cm2，一般0.31.2 kg/cm2）采用颗粒直径介于经典柱层析（100200m）和HPLC（37m）之间的薄层层析用硅胶（或氧化铝）H或G（5075m）作为填充剂的一种柱层析柱，其基本原理与HPLC相同，分离效果也介于经典柱与HPLC之间，用减压干法装柱，铺层紧密均匀，层析带分布集中整齐，同时薄层层析的最佳分离溶剂系统可以直接用于低压柱层析，它是一种分离效果较好，设备简单，操作方便，快速的方法。适宜和于天然产物的常量制备性分离。（1）装柱 减压干法装法，层析柱规格：柱长30cm，内径2cm，共装硅胶约30g（高约22cm）。（2）拌样加样 取汉防已碱约150mg，加少量丙酮热溶（刚溶为度）用滴管加到1.5g硅胶上，仔细拌匀，水浴上蒸干，碾细，通过一个长颈漏斗小心加在柱顶，轻轻垂直顿击，待样品表面平整不拌动时，上面再盖约12cm高的空白硅胶，再加盖一园形滤纸片，压紧。（3）洗脱 先检查从空压机至层析柱各阀门管道是否正常，关紧各个阀门，开动空压机至额定压力（5.8kg/cm2）待用。用滴管顺层析柱柱壁仔细加入少量洗脱剂（环已