中华鳖线粒体基因组序列分析.docVIP

1 蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅莅蒁螈肁莄蚃薁羇莄莃袇袃莃蒅虿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃蒀莀袃衿葿蒂蚆膈蒈薄袁膄蒈螇螄肀蒇蒆羀羆肃薈螃袂肂蚁羈膀肂莀螁肆膁蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚂袆羅膆莁虿袁膅蒄袄膀芄薆蚇肆芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅莅蒁螈肁莄蚃薁羇莄莃袇袃莃蒅虿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃蒀莀袃衿葿蒂蚆膈蒈薄袁膄蒈螇螄肀蒇蒆羀羆肃薈螃袂肂蚁羈膀肂莀螁肆膁蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚂袆羅膆莁虿袁膅蒄袄膀芄薆蚇肆芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅莅蒁螈肁莄蚃薁羇莄莃袇袃莃蒅虿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃蒀莀袃衿葿蒂蚆膈蒈薄袁膄蒈螇螄肀蒇蒆羀羆肃薈螃袂肂蚁羈膀肂莀螁肆膁蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚂袆羅膆莁虿袁膅蒄袄膀芄薆蚇肆芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅莅蒁螈肁莄蚃薁羇莄莃袇袃莃蒅虿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃蒀莀袃衿葿蒂蚆膈蒈薄袁膄蒈螇螄肀蒇蒆羀羆肃薈螃袂肂蚁羈膀肂莀螁肆膁蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚂袆羅膆莁虿袁膅蒄袄膀芄薆蚇肆芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅莅蒁螈肁莄蚃薁羇莄莃袇袃莃蒅虿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃蒀莀袃衿葿蒂蚆膈蒈薄袁膄蒈螇螄肀蒇蒆羀羆肃薈螃袂肂蚁羈膀肂莀螁肆膁蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚂袆羅膆莁虿袁膅蒄袄膀芄薆蚇肆芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅莅蒁螈肁莄蚃薁羇莄莃袇袃莃蒅虿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃蒀莀袃衿葿蒂蚆膈蒈薄袁膄蒈螇螄肀蒇蒆羀羆肃薈螃袂肂蚁羈膀肂莀螁肆膁蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚂袆羅膆莁虿袁膅蒄袄膀芄薆蚇肆芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羁袃芀蚃螃膂芀莂罿肈艿蒄螂羄芈薇羇袀莇虿螀腿莆荿薃肅 节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂聿芁薅袄袂膇薄薄肇肃膁蚆袀罿膀螈肆芈艿蒈袈膄芈薀肄肀芇螃袇肆芇袅螀莅芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肂芃葿螆羈莂薁羂芇莁蚄螄膃莁袆羀腿莀薅袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀肆膆莆薂衿肂蒅蚄肅羈蒅螇袈芆蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂聿芁薅袄袂膇薄薄肇肃膁蚆袀罿膀螈肆芈艿蒈袈膄芈薀肄肀芇螃袇肆芇袅螀莅芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肂芃葿螆羈莂薁羂芇莁蚄螄膃莁袆羀腿莀薅袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀肆膆莆薂衿肂蒅蚄肅羈蒅螇袈芆蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂聿芁薅袄袂膇薄薄肇肃膁蚆袀罿膀螈肆芈艿蒈袈膄芈薀肄肀芇螃袇肆芇袅螀莅芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肂芃葿螆羈莂薁羂芇莁蚄螄膃莁袆羀腿莀薅袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀肆膆莆薂衿肂蒅蚄肅羈蒅螇袈芆蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂聿芁薅袄袂膇薄薄肇肃膁蚆袀罿膀螈肆芈艿蒈袈膄芈薀肄肀芇螃袇肆芇袅螀莅芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肂芃葿螆羈莂薁羂芇莁蚄螄膃莁袆羀腿莀薅袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀肆膆莆薂衿肂蒅蚄肅羈蒅螇袈芆蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂聿芁薅袄袂膇薄薄肇肃膁蚆袀罿膀螈肆芈艿蒈袈膄芈薀肄肀芇螃袇肆芇袅螀莅芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肂芃葿螆羈莂薁羂芇莁蚄螄膃莁袆羀腿莀薅袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀肆膆莆薂衿肂蒅蚄肅羈蒅螇袈芆蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂聿芁薅袄袂膇薄薄肇肃膁蚆袀罿膀螈肆芈艿蒈袈膄芈薀肄肀芇螃袇肆芇袅螀莅芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肂芃葿螆羈莂薁羂芇莁蚄螄膃莁袆羀腿莀薅袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀肆膆莆薂衿肂蒅蚄肅羈蒅螇袈芆蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇薇虿螄莅薆螂 膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃羀膃薇螆螃聿薆蒅罿羅膂薇螂袁膁螀肇艿膁葿袀膅膀薂肅肁腿蚄袈羇膈螆蚁芆芇蒆袆膂芆薈虿肈芅蚁袅羄芅蒀蚈羀芄薃羃芈芃蚅螆膄节螇羁肀芁蒇螄羆莀蕿羀袂荿蚁螂膁荿莁羈膇莈薃螁肃莇蚆肆罿莆螈衿芈莅蒈蚂膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃羀膃薇螆螃聿薆蒅罿羅膂薇螂袁膁螀肇艿膁葿袀膅膀薂肅肁腿蚄袈羇膈螆蚁芆芇蒆袆膂芆薈虿肈芅蚁袅羄芅蒀蚈羀芄薃羃芈芃蚅螆膄节螇羁肀芁蒇螄羆莀蕿羀袂荿蚁螂膁荿莁羈膇莈薃螁肃莇蚆肆罿莆螈衿芈莅蒈蚂膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃羀膃薇螆螃聿薆蒅罿羅膂薇螂袁膁螀肇艿膁葿袀膅膀薂肅肁腿蚄袈羇膈螆蚁芆芇蒆袆膂芆薈虿肈芅蚁袅羄芅蒀蚈羀芄薃羃芈芃蚅螆膄节螇羁肀芁蒇螄羆莀蕿羀袂荿蚁螂膁荿莁羈膇莈薃螁肃莇蚆肆罿莆螈衿芈莅蒈蚂膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃羀膃薇螆螃聿薆蒅罿羅膂薇螂袁膁螀肇艿膁葿袀膅膀薂肅肁腿蚄袈羇膈螆蚁芆芇蒆袆膂芆薈虿肈芅蚁袅羄芅蒀蚈羀芄薃羃芈芃蚅螆膄节螇羁肀芁蒇螄羆莀蕿羀袂荿蚁螂膁荿莁羈膇莈薃螁肃莇蚆肆罿莆螈衿芈莅蒈蚂膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃羀膃薇螆螃聿薆蒅罿羅膂薇螂袁膁螀肇艿膁葿袀膅膀薂肅肁腿蚄袈羇膈螆蚁芆芇蒆袆膂芆薈虿肈芅蚁袅羄芅蒀蚈羀芄薃羃芈芃蚅螆膄节螇羁肀芁蒇螄羆莀蕿羀袂荿蚁螂膁荿莁羈膇莈薃螁肃莇蚆肆罿莆螈衿芈莅蒈蚂膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃羀膃薇螆螃聿薆蒅罿羅膂薇螂袁膁螀肇艿膁葿袀膅膀薂肅肁腿蚄袈羇膈螆蚁芆芇蒆袆膂芆薈虿肈芅蚁袅羄芅蒀蚈羀芄薃羃芈芃蚅螆膄节螇羁肀芁蒇螄羆莀蕿羀袂荿蚁螂膁荿莁羈膇莈薃螁肃莇蚆肆罿莆螈衿芈莅蒈蚂膄莄薀袇肀蒃蚂蚀羆蒃莂袆袂蒂蒄蚈芀蒁蚇袄膆蒀蝿螇肂葿葿羂羈蒈薁螅芇蒇蚃 中华鳖线粒体基因组序列分析中华鳖线粒体基因组序列分析 合肥一中生物组合肥一中生物组 彭巧玲彭巧玲 摘要：摘要：参照近源物种线粒体基因组序列,设计17 对特异引物,采用PCR 产物直接测序法测得中 华鳖线粒体基因组全序列. 初步分析其基因组特点和各基因的定位,用pDRAW32 软件预测12 种 限制性酶对其的酶切图谱. 结果表明,中华鳖线粒体基因组全长17 364 bp ,核苷酸组成为 35.23 %A、27.26 % T、25.73 % C、11.78 % G,包括13 个蛋白质编码基因、2 个rRNA 基因、 22 个tRNA 基因和1个非编码控制区. 基于线粒体基因组编码的13 个蛋白质的氨基酸序列,用 NJ 法和MP 法构建系统进化树,分析6 种龟鳖类动物之间的亲缘关系,与传统的系统分类基本一 致,初步确定淡水龟科与海龟科的亲缘关系比与龟科的亲缘关系要近. 关键词：关键词：中华鳖, 线粒体基因组, 序列分析,系统进化树 Complete Mitochondrial Genome Sequence Analysis of Chinese Softshell Turtle( Pelodiscus sinensis) Abstract：The complete mitochondrial genome of Chinese softshell turtle Pelodiscus sinensis was obtained by DNA sequencing based on the PCR fragments of 17 pairs of primers we designed on the basis of mtDNA sequences of three related turtle species. The entire genome was 17 364 base pairs in length, with a gene content of 13 protein-coding ,two ribosomal RNA and 22 transfer RNA genes ,and order identical to that observed in most other vertebrates. Those genes are arranged compactly with no introns and few intergenic nucleotides. The tRNAGln, tRNAAla, tRNAAsn, tRNACys, tRNATyr, tRNASer (CUN) , tRNAGlu , tRNAPro and ND6 genes are encoded on the light strand, and the remainder is on the heavy strand. The overall base composition is 35.23A, 27.26%T, 25.73%C, 11.78%G. The sequence was submitted to GenBank and got a GenBank accession number: NC_006132. Based on the concatenated sequences of 13 inferred amino acid of protein-coding genes, we constructed the phylogenetic tree with Neighbor-joining (NJ) and Maximum parsimony (MP) method and discussed the phylogenetic relationships of six turtles.The result demonstrated that, among Cheloniidae,Bataguridae and Emydidae,the former two had closer relationship. Key words：Pelodiscus sinensis , mitochondrial genome , sequence analysis , phylogenetic tree 龟鳖类是形态学上最特化的一支爬行动物1，被分为两个特征明确的支系 侧颈龟亚目和曲颈龟亚目，现有关于龟鳖目进化和系统学关系的学说大多以形态 学研究为基础2,3。随着系统学研究的不断深入，分子进化分析技术逐渐发展起来， 国内外有关龟鳖目分子系统学的研究已开展了一些工作4-8。由于线粒体基因组 2 DNA（mtDNA）是核外遗传物质，具有结构简单、很少受到序列重排的影响、呈母 系遗传等特点9,10，近年来，以 mtDNA 为对象研究龟鳖类系统进化被研究者们广 泛采用，并由对其中某个或某几个基因的研究发展到对线粒体全基因组的研究4-8。 目前，国外已有马来亚鳖（Dogania subplana） 、绿海龟（Chelonia mydas） 、锦龟 （Chrysemys picta）和非洲侧颈龟（Pelomedusa subrufa） (GenBank 登录号分别为： NC_002780、AB012104、NC_002073、AF039066) 4 种龟鳖类动物的线粒体全基 因组序列被测定。据统计，全世界龟鳖类动物约有 13 科、89 属、270 余种1，众 多的龟鳖类物种中，4 个物种的量显然是有限的，进一步的研究很有必要。国内关 于龟鳖类动物 mtDNA 的研究很少，仅吴平等8在 1999 年对部分亚洲淡水和陆生龟 鳖类 12SrRNA 基因片段进行了研究，而线粒体全基因组的研究尚未见报道。 中华鳖隶属龟鳖目曲颈龟亚目鳖科华鳖属1，分布在我国及东南亚地区，是 鳖科的代表动物，食用和药用价值很大。本文对中华鳖（Pelodiscus sinensis）的线 粒体基因组全序列进行了测定和分析，以期为研究龟鳖类动物的系统进化提供分 子水平的资料。 1 材料与方法材料与方法 1.1 实验材料实验材料 中华鳖，购于安徽芜湖吉和水产市场。 1.2 基因组基因组 DNADNA 提取提取 采用 Sambrook 等的方法11，取中华鳖肌肉组织，用 SDS/蛋白酶 K 裂解，酚 氯仿提取总 DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。 1.3 引物设计和引物设计和 PCR 扩增扩增 参照马来亚鳖（D. subplana） 、绿海龟（C. mydas） 、锦龟（C. picta）3 种动物 的线粒体基因组全序列，采用 CLUSTAL X1.8 软件进行序列比对排列后，用 Oligo6.0 软件设计可覆盖中华鳖线粒体全基因组的引物 17 对（引物信息见 Table 1）。考虑 到当前的测序能力，这些引物的 PCR 产物长度均不超过 1 500 bp,产物之间相互重 叠片段长度约 80250 bp。 PCR 扩增反应体积为 25l：模板 DNA 100 ng、10Buffer 2.5l、MgCl2(2.5 mol/L) 2l、dNTP 1.5l 、上下游引物（25mol/L） 0.25l、1 U TaqDNA 聚合酶（5 Ul,上海博之鑫生物技术有限公司），加纯 水补足。PCR 反应的循环参数为：94 变性 40 s，5056 退火 40 s，72 延伸 1 min，35 个循环，72 延伸 10 min。用 1.0 % 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成 像仪扫描记录结果。 3 表表 1 用于扩增中华鳖 mtDNA 的 17 对引物 Table 1 Oligonucleotide primers used to amplify and sequence P. sinensis mtDNA in this study No. Upper primer Lower primer Product Length Upper primer sequence(53)Lower primer sequence(53) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 L19 L1067 L2136 L3171 L4295 L5434 L6349 L7605 L8669 L9495 L10519 L11780 L12830 L13339 L14201 L15291 L16236 H1252 H2217 H3340 H4511 H5495 H6591 H7806 H8776 H9718 H10678 H11968 H12917 H13596 H14458 H15424 H16447 H141 1234 1151 1205 1341 1201 1158 1458 1172 1050 1184 1450 1138 767 1120 1224 1157 1270 AAAGCATGGCACTGAAGACGC AAAGCATTCAGTTTACACCTGA CTCTTACAGCTAATCAGTGA TCCGGTTGAGCTTCA AACTC ATGAAACTAGGATTAGCCCCA TTATTTTCTACTAACATAAAG GCTATCCCAACAGGAGTAAAAG AAACCGATGCCATCCCAGGACG GCCTATACTTACAAGAAAAT AGTATAAATGACTTCCAATCA GAACCCCTATCACGAAAACG GATAACAGCTTAATCCACTGG TATACATGCCTTCTTCAAAGC TAGCCCTTGAACTAATCACA AACCACCGTTGTATTCAACTA AGCAGCCTCCATCCTATACTT AACTGATCTATTCTGGCATCT TTTCAATTTTCCCTTGCGGTAC AAGTTCCGCAGGGTCTTCTCG ACTAGTAGTATTGGTTCTTG GTAGTTGGGTTTGGTTTA ATCC CGGTGCCTGAGCAGGTATAGT AAATCCTGCTATAATAGCGAA GCTATCCTGTTTAGCTTCTATAG GTTAATAGTAATGCTGCTGTTGC GAA AATCGAATTGAGAATGG TTTGATTACCTCATCGTGTA GCTGTTTTTACGGCGGTTTTG TATTTTTCGAATGTCTTGTTC GGTAGATTTTGATTAGTCCTT ATTGTACATCTCGGGTAATG CATTCTTTGGTTTACAAGACC CAGTTTCATTGAGTTGGCAG TTCACTGGTATGCTGATACTT Note：L in Line 2 and H in Line 3 ,behind which the numbers are positions of each primer 5-end in the Mitochondial genome of Pelodiscus sinensis, stand for the light strand and the heavy strand . PCR 扩增产物经纯化试剂盒（Vgene DNA 凝胶回收试剂盒）纯化后，委托 上海博亚生物公司进行测序（ABI-3 730 全自动测序仪） 。 1.4 序列分析序列分析 用 BioEdit 软件辅助，人工进行序列拼接，得到中华鳖线粒体全基因组序列。 用 BioEdit 软件统计序列总长、碱基百分比、GC 含量等信息。通过与马来亚鳖线 粒体基因组比较及软件分析DNASTAR、tRNA Scan-SE1.21(http: / tRNA Scan-SE)定位 tRNA 基因、蛋白编码基因、rRNA 基因和 D-loop 区，并登陆 GenBank，登录号为 NC_006132。利用 RNAStructure3.71 软件分析 tRNA 及 stem- loop 二级结构。 利用 pDRAW32 软件选取 EcoR、BamH、Hind、Bgl、Bgl、EcoR、Sac、Pst、Apa、Cla 、Ava和 Kpn12 种限制性酶10进行酶切图谱预测。 使用 MEGA 2.1 软件，采用邻接法（NJ 法）和最大简约法（MP 法） ，以扬子 4 鳄线粒体基因组（登录号为 AF511507）13 个蛋白质的氨基酸序列按顺序连接起来 的序列为外群，选取中华鳖、非洲侧颈龟、马来亚鳖、绿海龟、锦龟和乌龟（乌 龟线粒体全基因组序列是本实验室测得，登录号为 AY676201）的相应序列构建系 统进化树，进一步确定这 6 种龟鳖类动物的系统进化关系。 2 结果与分析结果与分析 2.1 PCR 结果结果 利用上述 17 对引物和反应条件进行扩增，得到 17 个 PCR 产物，电泳结果如 Fig.1，PCR 产物的长度与引物设计的预期产物长度一致，且条带特异清晰，说明 PCR 产物可信，可用来测序。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 图图 1 PCR 产物电泳图 Fig.1 PCR products covering the complete mitochondrial genome of Pelodiscus sinensis M: Mark 1: 1234 bp 2: 1151 bp 3: 1205 bp 4: 1341 bp 5: 1201 bp 6: 1158 bp 7: 1458 bp 8: 1172 bp 9: 1050 bp 10: 1184 bp 11: 1450 bp 12: 1138 bp 13: 767 bp 14: 1120 bp 15: 1224 bp 16: 1157 bp 17: 1270 bp 2.2 中华鳖线粒体基因组总长和碱基组成中华鳖线粒体基因组总长和碱基组成 测序后序列拼接得到中华鳖线粒体基因组序列全长17 364 bp，其长度与马来 亚鳖的相似，比已知的四种龟的线粒体基因组长500800 bp（见Table 2 2）。它们 之间长度的差异主要体现在控制区，中华鳖和马来亚鳖控制区分别为1830bp和 1820bp，而四种龟的只有9501 200 bp. 中华鳖的控制区内存在较长的重复拷贝 序列，如: 5-TTACACTTTTTTTCTTCTCCCGCGCCCAAGAGACATTTAGCCCCTCTATA-3(50 bp重复3次)。 表表2 2 六种龟类动物mtDNA全序列的碱基组成 Table 2 Nucleotide frequence and proportion of six turtles Nucleartide frequency/ProportionSpecies/ Accession numberAC GT Length (bp) 5 Pelodiscus sinensis/ NC_006132 Dogania subplana/ NC_002780 Chinemys reevesi/ AY676201 Chelonia mydas/ AB012104 Chrysemys picta/ NC_002073 Pelomedusa subrufa/ AF039066 6117/35.23 6103/35.30 5635/33.99 5839/35.39 5810/34.45 5693/33.91 4468/25.73 4631/26.79 4383/26.44 4539/27.51 4376/25.95 4466/26.60 2045/11.78 2066/11.95 2145/12.94 1969/11.94 2165/12.84 2031/12.10 4734/27.26 4489/25.96 4413/26.62 4150/25.16 4515/26.77 4597/27.38 17364 17289 16576 16497 16866 16787 利用BioEdit软件统计中华鳖线粒体基因组L链的碱基百分含量为A(35.23) T%(27.26%) C%(25.73%) G%(11.78%) , 其AT含量62.49%远高于GC含量 37.51%。这与马来亚鳖、绿海龟等其他龟鳖类动物是相似的（见Table 2）。 2.3 中华鳖线粒体基因组基因定位中华鳖线粒体基因组基因定位 中华鳖线粒体基因组包括 37 个基因：2 个 rRNA、22 个 tRNA 和 13 个蛋白编 码基因以及 1 个非编码控制区（D-loop 区） ，且基因排列顺序与大多数脊椎动物相 似，相邻基因间有时稍有重叠（见 Fig.2） 。2 个 rRNA 基因（12SrRNA 和 16SrRNA 基因）均在 L 链上； 22 个 tRNA 基因（包含 2 个 tRNASer和 2 个 tRNALeu）中，tRNAGln 、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer（第一 个） 、tRNAGlu、tRNAPro在 H 链上，其余 14 个在 L 链上；13 个蛋白编码基因除 ND6 在 H 链外均在 L 链上。在 tRNATrp-tRNAAla- tRNAAsn-tRNACys-tRNAPro基因 簇区的 tRNAAsn 和 tRNACys之间为一 34 bp 的片段，可形成 “stem-loop”结构 (见 Fig.3)，是 L 链的复制起点 OL（the origin of light-strand replication） 。 图图2 中华鳖线粒体基因组简图 Fig. 2 Mitochondrial genome of Pelodiscus sinensis ND16, and ND4L: subunits 16 and 4L of nicotine amid adenine dinucleotide dehydrogenase; 6 A 6 and 8: subunits 6 and 8 of adenine triphosphatase; CO1-3: cytochrome c oxidase subunits 1-3; 12S and 16S:12 and 16S rRNA. Each tRNA gene is identified by the single-letter amino acid code.OL represent the replication origins of L-strand. The hatched areas show L-strand-encoded genes. 图图3 3 中华鳖轻链复制起点“茎环”结构 Fig.3 The stem-loop structure of Pelodiscus sinensis 2.42.4 中华鳖线粒体基因组限制性酶酶切图谱分析中华鳖线粒体基因组限制性酶酶切图谱分析 利用pDRAW32软件预测了中华鳖线粒体基因组的12种限制性酶酶切图谱（见Fig. 4） ，并统计了每种限制酶的酶切位置和酶切片段长度（见Table 3） ，其中Pst没有 酶切位点。 表表3 中华鳖mtDNA12种限制酶的酶切位置和酶切片段长度 Table 3 The positions and length of restriction fragments in the mitochondrial genome of Pelodiscus sinensis Restriction enzymes Recognition site Number of the fragments Positions and length of restriction fragments EcoR BamH Hind Bgl Bgl EcoR Sac Pst Apa Cla Ava Kpn GAATT_C GGATC_C AAGCT_T GCCn_nnnnGGC AGATC_T GATATC G_AGCTC 无 G_GGCCC ATCG_AT CyCGr_G G_GTACC 2 2 4 4 1 1 1 3 3 7 1 7442(1610)9052(15754) 13931(617)14548(16747) 268(3352) 3620(314)3934(84)4018(13614) 2944(3078)6022(5119)11141(1628)12769(7539) 14916（17364） 13564(17364) 9134(17364) 3946(2333)6279(9432)15711(5599) 653(7465)8118(5496)13614(4403) 14444(1260)15704(50)15754(49)15803(50)15853(50)15903(25 9)16162(15646) 620(17364) 7 图图4 中华鳖线粒体基因组的12种限制性酶酶切图谱 Fig.4 Restriction enzyme map of mitochondial genome of Pelodiscus sinensis 2.52.5 构建系统进化树构建系统进化树 基于线粒体基因组13个蛋白编码基因的氨基酸序列构建系统进化（Fig. 5） 。结 果显示，以NJ法和MP法构建的两种系统进化树的拓扑结构高度一致：6种龟鳖类 动物分为3支，曲颈龟亚目海龟科的绿海龟1与淡水龟科的乌龟1先聚为一支，然 后与同亚目龟科的锦龟1并为一支（A支） ；曲颈龟亚目鳖科的中华鳖与马来亚鳖1聚 为一支（B支） ；侧颈龟亚目侧颈龟科的非洲侧颈龟1单独成为一支（C支） 。扬子 鳄作为外群位于系统树的基部。每个分支的置信度均高于90。 图图5 用NJ和MP法构建的6种龟类动物的系统进化树 Fig. 5 Neighbor-joining and Maximum parsimony trees among 6 turtles Numbers at each branches are bootstrap values derived from 1 000 replications. 3 讨论讨论 中华鳖线粒体基因组与多数脊椎动物的排列顺序相似，且已知的 6 种龟鳖类 动物的线粒体基因组基因排列顺序完全相同，表明龟鳖类线粒体基因组在进化上 的高度保守性。中华鳖 mtDNA 的 tRNATrp-tRNAAla-tRNAAsn-tRNACys-tRNAPro区包 含一个典型的“stem-loop”结构，马来亚鳖、乌龟、绿海龟、锦龟也有此结构， 8 但非洲侧颈龟没有5。这个区域被认为是 L 链的复制起点（OL）4,16，在很多脊椎 动物，如石龙子4、蛇类12、鱼类13,14、两栖类15,16、哺乳类17等都有类似结构， 但在楔齿蜥18、鸟类19、鳄类20,21中尚未发现。由此看来，这个结构特征似乎具 有种属特异性，推测它在脊椎动物线粒体基因组中可能是一个比较进化的特征。 控制区是 mtDNA 中的非编码序列，在进化过程中选择压力相对较小，较线粒 体其他区域具有更大的多态性，其碱基替换率是 mtDNA 其他区段的 5 倍22,23。控 制区的长度在脊椎动物各类群变异较大，这种变异在龟鳖类中也有很好的体现。 我们在对这 6 种龟鳖类动物 mtDNA 进行序列分析时发现，四种龟的控制区长度在 9501 200 bp 之间，与大多数脊椎动物相似；本研究测得中华鳖控制区长 1 830bp，与马来亚鳖的控制区长度（1 820bp）十分接近，比四种龟的长 600800bp。这个结果似乎提示鳖类的控制区较长，但要确定这是不是所有鳖类 动物的共同特征，有待于进一步地研究。 龟鳖类动物在脊椎动物的系统演化中有承前启后的重要地位，但是关于它们 的系统分类一直在争论当中3,7。前人已从形态学、染色体等方面2进行过研究， 但难以得到一致的结论，也有学者利用核基因24或线粒体部分序列（如 Cyt b）进 行研究25，但由于信息量太小，得出的结论有限。近年来人们开始利用线粒体全 基因组序列进行龟鳖类的系统学分析4-6，国际上常采用将线粒体基因组中 13 个蛋 白编码基因或轻链上 12 个蛋白编码基因的氨基酸序列按顺序连接起来构建系统进 化树，分析种间种内的系统进化关系4,26-28。本文基于 6 种龟鳖类动物线粒体基因 组 13 个蛋白编码基因的氨基酸序列构建的系统进化树中反映的系统进化关系与传 统的系统分类基本一致。此外，A 支中乌龟和绿海龟先聚为一支再与锦龟并为一 支，提示淡水龟科与海龟科的亲缘关系比与龟科的亲缘关系要近，这与吴平等基 于 12SrRNA 基因序列的研究结果也是一致的8。 参考文献参考文献(References) 1周婷，赵尔宓.龟鳖分类图签. 北京：中国农业出版社,2004. 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