甲胺磷降解菌的分离、筛选、鉴定.doc

甲胺磷降解菌的分离、筛选、鉴定 官雪芳 2 林抗美1 马丽娜1 林斌 2 刘波 1* （1 福建省农业科学院生物技术研究所，2福建省农科院农业工程技术研究所,福建 福州 350003） 摘要: 对福建省福农生化有限公司排污口,沟口及周边土壤的甲胺磷降解菌进行分离鉴定,共 得到 27 个属 50 株细菌,为了得到高效的甲胺磷降解菌，实验采用临界浓度法筛选甲胺磷降 解菌，研究确定了使菌的致死剂量达到 70%时的甲胺磷浓度为 46 g/L，以该浓度为条件筛 选出一株真菌青霉菌属，该菌在低甲胺磷浓度（300mg/L）时的平均降解解率可达 62.13%。 关键词: 甲胺磷 降解 细菌 Isolation, screening and identification of bacterium strains for methamidoghos degradation GUAN Xuefang2, LIN Kangmei1, MA Lina1,LIN Bin2,LIU Bo1* (1Biotechnology Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，350003, China)(2Institute of Agricultural Engineering Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，350003, China) Abstrat: By using selective media, 50 species of bactera with the capability of methamidoghos degradation which belong to 27 genera respectively were separated from the soil around pesticide factory,where pesticides containing waste water flowed frequently. In order to screen high methamidophos-degrading bacteria, we used the critical concentration method with concentration was 46 g / L to screen methamidophos-degrading bacteria,Finally the Penicillium spp. with high methamidophos-degrading was isolated, with the degradation rate of 61.23%. Key word: methamidophos degrade bacteria 随着现代农业的发展,世界范围内使用的农药和用量不断增加。目前,全世界每年要销售 200多万吨农药,生产农药品种约有700多种，但只有大约1%作用于靶标生物,其余的或残留 于土壤,或通过径流进入水域，造成了土壤、水体及空气的污染，破坏生态系统结构，影响 生物生长，危害人类健康。有机磷农药一直是我国用量最大的农药种类，每年都在十万吨 以上，与此同时也带来了很大的污染问题，我国农副产品因残留量超标对其出口造成了巨 大的经济损失，也严重影响了我国的外贸信誉。微生物是导致环境中有机磷农药降解的主 要方式，它可以通过矿化作用、共代谢作用、种间协同代谢等作用机理将有机磷农药降解， 这是国际上正在发展的一项环保新产业。研究筛选出高效的有机磷降解菌，研究其对有机 磷的降解特性及机理，并将其应用于农产品、土壤中或水体中的有机磷农药残留中，将可 以大大减少农药污染带来的危害，挽回巨大的经济损失。 基金项目基金项目：福建省科技厅项目有机磷农药降解剂“降磷灵”的研制 ， （编号：2005Y008） 。 作者简介作者简介：官雪芳，女，1979 年生，福建南平人，硕士，研究实习员，主要从事环境微生物方面的研究。 E-mail: 。 *通讯作者 通讯作者：刘波，男，博士，研究员，主要从事生物技术和生物防治研究，E-mail：。 本研究对福建省福农生化有限公司排污口,沟口及周边土壤的甲胺磷降解菌进行分离, 并 对分离的细菌利用全自动微生物鉴定系统进行鉴定，初步了解该农药厂周边的甲胺磷降解菌 的种类及种群结构,并进一步对这些菌进行了再次筛选,为今后菌降解甲胺磷等有机磷农药的 研究奠定基础。 1 1 材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 1.1.1 从福建省福农生化有限公司排污口采集土样11处，分别记为G1、G2、 G11。 .2 药品药品 有机磷农药类：50%甲胺磷乳油（江门市大光明农化有限公司） ，甲胺磷标样（Sigma- Alddrich 公司） 。有机溶剂类：丙酮（分析纯） 、二氯甲烷、甲醇（色谱纯） 、正已烷甲基 叔丁基乙醚（fisher公司）、脂肪酸混合标样（C9至C20）、乙醇、乙醚等。酸碱盐类：无 水硫酸钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠（优级纯）等。 .3 仪器仪器 Agilent1100 HPLC仪（带VWD检测器及色谱工作站） （日）,色谱柱：HypersiL ODS C18反相柱（4.0 mm250 mm，填料孔径5 um） ；气相色谱仪：检测器（FPD,Agilent毛细管 色谱柱，HP-5 ( 30m0.32mm 0.25um)；真空抽滤器(2XZ-0.5型选片真空泵，浙江黄岩真空 泵厂)；恒温箱，pH计，水浴锅等。 .4 培养基培养基 Burk无机盐培养基：含0.2g/L K2HPO4，0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO47H2O,0.1 g/L CaSO4H2O, 0.003g/L NaMoO42H2O,0.005g/L FeSO47H2O,1.0g/L (NH4)2SO4和0.5 g/L酵母粉； pH 7.2、121灭菌20min固体培养基加入1.5%琼脂。葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨6.5克、 葡萄糖6.5克、K2HPO4 2克、水1000毫升、PH：7.0 （固体培养基加琼脂20克）。葡萄糖蛋 白胨水培养基-1：蛋白胨1克、葡萄糖1克、K2HPO4 1克、琼脂 20克、水1000毫升 PH：7.0。琼脂培养基：琼脂20克、水1000毫升PH：70。TSB培养基（BD公司，货号 81125）。 1.21.2 实验方法实验方法 .1 甲胺磷降解菌的初筛甲胺磷降解菌的初筛 取以上 11 处土样各 0.5g 于 100ml 液体葡萄糖蛋白胨水培养基中 32振荡培养 24h， 将以上菌液接种于含甲胺磷终浓度 3000 mg/L 的液体 Burk 无机盐培养基中培养至菌液出现 浑浊，将菌液用无菌水稀释至 10-1，分别吸取 0.1ml 涂布于分别含有甲胺磷的终浓度分别 为 3000 mg/L、4000 mg/L 的 A、B、C 培养基中，32培养箱中培养，观察其生长状况， 挑取各不同的单菌经平板画线纯化、保存。 .2 甲胺磷甲胺磷降解菌的鉴定降解菌的鉴定 （1）脂肪酸提取前处理试剂配制 试剂1：NaOH45 g+甲醇（HPLC grade）150 ml+去离子蒸馏水150 ml，水和甲醇混合 后加入NaOH中，同时搅拌至完全溶解。试剂2：6.00N 盐酸 25ml+甲醇（HPLC grade） 275ml，把盐酸加入到甲醇中，并不断搅拌。试剂3：正己烷 (HPLC Grade ) 200ml+MTBE (HPLC Grade ) 200ml，把MTBE加入到正己烷中，并搅拌均匀。试剂4：NaOH 10.8g+去离 子蒸馏水 900 ml。 （2）菌株的培养 将菌株采用图 1 所示的四区画线法在 TSBA 平板上划线，置于 30暗培养箱培养 24h。(可通过四区不同密度的菌体去确认是否纯化，最佳获菌区为第三区，此区必须有菌 落并且量要足够多。) 图 1 四区画线式样(Quadrant streak pattern) （3）脂肪酸鉴定的前处理 获菌：用接种环挑取 35 环（约 40mg）湿重的菌落置于清洁干燥的有螺旋盖的试管 （13mm100mm）底部。皂化：（强烈的甲醇随着加热杀菌及溶解细菌）：在装有菌体的 试管内加入 1.00.1mL 试剂 1，锁紧盖子，震荡试管 5-10 s，95100水浴 5min，从沸水 中移开试管并轻微的冷却，震荡 5-10 s，再水浴 25 min，取出室温冷却。甲基化：（甲基 化转换脂肪酸成甲基酯脂肪酸以增加脂肪酸的挥发性以供 GC 分析）：加入试剂 22.00.1mL，拧紧盖子，震荡 5-10s，80水浴 10min，移开且快速用流动自来水冷却至室 温。萃取：（甲基酯脂肪酸从酸性水相移出转移到一个有机相的萃取过程）：加入 1.250.1mL 的试剂 3 萃取溶剂，盖紧盖子，温和混合旋转 10min ，打开管盖，利用干净 的移液管取出下层似水部份，弃去。基本洗涤：（从有机相中移去自由的脂肪）：加入 3.00.21mL 试剂 4，拧紧盖子，温和混合旋转 5min，打开盖子，利用干净的移液管移出约 2/3 体积的上层有机相到干净的 GC 检体小瓶。 （此过程要小心，宁可少取有机相，绝不可 吸入水相，否则会对损坏细菌鉴定仪的色谱柱。 ） （3）样品脂肪酸成份检测 在下述气相色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱 温，170起始，经 5/min 升至 260 ，而后经 40/min 升至 310 ，维持 90S；汽化室 温度 250；检测器温度 300；载气为 H2 (2mL/min)，进样模式为分流进样，分流比为 100:1；辅助气：Air（350mL/min），H2（30mL/min）；尾吹气为 N2(30mL/min)；柱前压 l0.00 psi(1Psi= 6.895kPa)；进样量 lL。脂肪酸成份分析：系统根据各组分保留时间计算等 链长(ECL)值确定目标组分的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二 者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(similarityindex，SI)，从而给出一种或几 种可能的菌种鉴定结果。一般以最高 SI 的菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种 的 SI 比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断，以脂肪酸混合标样校 正保留时间。 .3 甲胺磷降解菌的复筛甲胺磷降解菌的复筛 本实验尝试采用临界浓度法筛选甲胺磷降解菌。方法为：在葡萄糖蛋白胨水培养基中 加入甲胺磷，使培养基中所含的甲胺磷的终浓度分别为 4000、6000，8000、10000、12000 （mg/L） ，取以上土样（用无菌水稀释） ，取稀释液 100uL 涂于各平板中。观察、记入其生 长状况。若各土样在以上浓度的甲胺磷培养基中均有菌生长，再提高甲胺磷的浓度，最后 选择使菌的致死剂量达到 70%左右时的浓度作为筛选甲胺磷降解菌的临界浓度，挑选出能 在该浓度上生长的菌种进行菌的降解率的测定，液相色谱操作条件: 流动相：V（甲醇：水） =15：85，流速：0.9mL/min，波长：215nm，出峰时间：5.67 min, 降解率(%)（对照样 品残留量处理样品残留量）100(%)/对照样品残留量。 3.3. 结果与分析结果与分析 3.13.1 农药降解菌的初筛农药降解菌的初筛 （1）各类样品在不同农药浓度的各类培养基中的生长状况 从表 1 中可以看出：菌的生长状况和采集的位置并没有相关的规律，但总体上在排污 口和沟口的土壤上分离出的菌在本实验中的培养基上的生长状况较草坪的要好。在 A、B、C 三种培养基中，以培养基 A 生长较好，但同时也发现在只含有琼脂和一定浓度甲 胺磷的培养基中也有菌落长出，并且很多菌可在甲胺磷浓度高达 5000 mg/L 的培养基上生 长。 表 1 各类样品在不同农药浓度的各类培养基中的生长状况 样品 G-1 G-3G-8G-2G-4G-5G-10G-6G-7G-9G-11 来源草坪草坪草坪沟口沟口沟口沟口污口污口污口污口 A:甲胺磷 4000mg/L + B:甲胺磷 4000mg/L + C：甲胺磷 4000 mg/L + C：甲胺磷 5000mg/L + 注：表中：A 为葡萄糖蛋白胨培养基；B 为葡萄糖蛋白胨培养基-1；C 为琼脂培养基。 “”为没有菌生长； “+”为刚有菌生长；“+”为有较多的菌生长；“+”为菌生长旺盛。 （2）部分土样中的菌在不同培养基上的生长状况图 图 2 为部分土样稀释 10-1倍后在含不同浓度农药的各培养基上的生长状况。从中分离、 纯化出的菌株 50 株。 A+甲胺磷 4000+G-5C+甲胺磷 5000+G-11 B+甲胺磷 4000+G-5C+甲胺磷 4000+G-4 图 2 菌株在不同培养基上的生长状况 注：图中 A 为葡萄糖蛋白胨培养基；B 为葡萄糖蛋白胨培养基-1；C 为琼脂培养基，图中乐果 3000 表示 培养基中加的是乐果，浓度为 3000mg/L，其它类推，图中的 G-X 为土样。 3.23.2 甲胺磷降解菌的鉴定甲胺磷降解菌的鉴定 从表2中可以看出，TSBA50数据库里，对50株菌株进行鉴定的结果，SI大于0.5的有38 株，其中有11株的SI值大于0.8；占总数的76%，介于0.3-0.5的有4株，只占总数的8%；小 于0.3的有8株，占总数的16% ，一共有27个属，说明能在含有3000、4000mg/L浓度甲胺磷 的培养基上生长的菌株的种类较丰富，这从一定意义上也说明在自然界中确实存在着大量 的对有机磷有降解作用的菌株。 表 2 甲胺磷菌株的脂肪酸鉴定结果 Sample IDSimilarity Index*Entry Name gxf-j510.37Acinetobacter calcoaceticus gxf-j520.586Acinetobacter calcoaceticus gxf-j310.145Aquaspirillum autotrophicum gxf-j9110.773Aquaspirillum autotrophicum gxf-j280.84Bacillus cereus GC subgroup A GXF-J130.85Bacillus cereus GC subgroup A gxf-j730.852Bacillus cereus GC subgroup A gxf-j330.871Bacillus cereus GC subgroup A gxf-j450.088Bacillus cereus GC subgroup B GXF-J210.772Bacillus megaterium GC subgroup A gxf-J580.781Bacillus megaterium GC subgroup A GXF-J620.848Bacillus megaterium GC subgroup A gxf-J230.86Bacillus megaterium GC subgroup A gxf-j320.538Cedecea davisae gxf-J1010.798Citrobacter freundii gxf-j810.883Enterobacter cancerogenus gxf-J8150.769Escherichia coli GC subgroup C (DNA homology with Shigella) gxf-J8160.734Escherichia coli GC subgroup E (DNA homology with Shigella) gxf-J750.116Ewingella americana gxf-j4100.676Hafnia alvei gxf-j490.696Hafnia alvei gxf-j1010.027Klebsiella pneumoniae ozaenae GC subgroup A gxf-j11130.796Kluyvera ascorbata GC subgroup B GXF-J610.338Kurthia sibirica gxf-J1060.2Pandoraea pnomenusa gxf-j840.609Pseudomonas aeruginosa gxf-J860.677Pseudomonas aeruginosa gxf-j1020.588Pseudomonas agarici gxf-j110.694Pseudomonas fluorescens biotype B gxf-J1030.269Pseudomonas putida biotype A gxf-j590.454Pseudomonas putida biotype A gxf-j11110.631Pseudomonas putida biotype A gxf-J8150.782Pseudomonas putida biotype A gxf-j11140.718Pseudomonas putida biotype B GXF-J1070.743Pseudomonas putida biotype B gxf-J11150.791Pseudomonas putida biotype B gxf-J4120.342Pseudomonas syringae syringae GXF-J1160.599Pseudomonas syringae syringae GXF-J870.892Pseudomonas vancouverensis gxf-j890.888Pseudomonas veronii gxf-j240.701Ralstonia pickettii (Burkholderia, Pseudomonas pickettii) gxf-j101-10.794Salmonella choleraesuis houtenae gxf-j4100.518Salmonella typhimurium GC subgroup B gxf-j1130.718Salmonella typhimurium GC subgroup B gxf-J1120.483Serratia marcescens GC subgroup A gxf-j1040.772Serratia odorifera gxf-jn20.793Serratia odorifera GXF-J290.848Serratia odorifera gxf-j960.885Stenotrophomonas maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) gxf-J4120.011Streptococcus mitis (72 h) 注：细菌鉴定仪对于 Similarity Index 的诠释：大于 0.500：说明匹配性很高，为典型的菌;大于 0.300 小于 0.500：说明匹配性较低，为非典型菌种;小于 0.300：说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近 的菌种 3.33.3 甲胺磷降解菌的复筛甲胺磷降解菌的复筛 经过反复实验，本实验确定使菌的致死剂量达到 70%左右的浓度作为筛选甲胺磷降解 菌的临界浓度为 46 g/L，图 3 为各土样中的菌及阴沟肠杆菌所能承受的甲胺磷的浓度。从 图 6 中可以看出，大部分菌都能在含有很高浓度的甲胺磷的培养基上生长，能在甲胺磷浓 度高达 50 g/L 的培养基上生长的占总样品数的 8%；能在 46g/L 的培养基上生长的占总样 品数的 25%。能在 40 g/L 的培养基上生长的占总样品数的 33%。本实验中的 G-6、G-10 及 G-11 土样可在甲胺磷浓度大于 46 g/L 的培养基上生长，其中 G-6、G-11 土样采自排污 口,G-10 土样采自沟口。经初步鉴定，该菌为真菌青霉菌属，其对甲胺磷的降解效果见表 3。 0 10 20 30 40 50 60 1234567891011 菌种 甲胺磷浓度(g/L) 图 3 各菌株所能生长的甲胺磷的临界浓度 从表 3 中可以看出：这一株可耐高浓度甲胺磷的菌株对甲胺磷有一定的降解作用，其 中在低浓度（300mg/L）时的平均降解解率可达 62.13%，但在浓度为 1000mg/L 时，平均 降解率却只有 14.925%。 表 3 菌对甲胺磷的降解情况 300（mg/L）1000（mg/L）甲胺磷理论 浓度 对照降解后浓度平均降解率 （） 对照降解后浓度平均降解率 （） 实际浓度 289.34109.762.662.13986.53820.697.814.925 33 4 4 结论结论 将微生物应用于有机磷的残留治理中是当前最经济实惠,最环保的一种方式,与其他物理, 化学