《硫酸铵纯化抗体》doc版.docx

1.兔抗人IgG抗体的初步纯化 ( 硫酸铵沉淀法） 一、 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。二、 试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三， 操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% 50% 。 （一）配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液(SAS)（ 4.1 mol/L, 25 C ）.（二）沉淀 1.样品（如腹水） 20 000 g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 C ），使蛋白质充分沉淀。 （三）透析 1.蛋白质溶液 10 000 g 离心 30 min （ 4 C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 四，应用提示 （一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 C ）；3.3000 g 离心 30 min （ 4 C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效 （二） 为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。纯化产物 的鉴定： （1）效价测定 : 采 用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1 1 000 开始倍比稀释)检测抗体的效价 。 （2）Ig亚类 ( 型 ) 的鉴定 : 用小鼠 Ig亚类检测试剂盒鉴定杂交瘤细胞培养上 清中 mA b 的 类和亚类 。（3）westernblot 鉴定抗体特 异性 : 取 5 g 人 IgG 经 SDS-PAGE后 , 转移至硝酸纤维素膜上 , 用 5 0 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h。依次滴加封闭液稀释的 5 mg/L纯化 抗体 (室温孵育2 h或 4过夜 ,洗膜3次)及11 000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠 Ig G(室温孵育1 h, 洗膜 3次)。最后加 DAB显色 ,观察结果 。（4） 相对亲和力测定 : 以 IgG与抗体结合曲线上部趋于平坦的一段(平台期)的吸光度值(A)为100%, 查出 A值为 50%点的抗体的浓度,以此来表示各株的相对亲和力 。1.为什么需要用透析袋透析？用透析袋透析以彻底除去硫酸氨；2.纯度如何简单鉴定？用BSA试剂盒测定抗体浓度，也可以用考马斯法、紫外法、双缩脲法等测定。3.为什么要进行活性鉴定？进行活性测定可以判定抗体效价，初步确定抗体的稀释