乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力模型的研究.docVIP

精品论文，值得推荐乙酰胆碱受体亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力模型的研究 作者：胡任飞，宋雅芳*，刘友章，李良龙，黄晓燕，陈裕杲，姬爱冬， 张久梅 【摘要】 目的研究用乙酰胆碱受体亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型。方法给实验组Lewis鼠皮下注射人工合成的鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段，观察接种后大鼠一般情况及体重、Lennon评分变化，应用低频重复电刺激检测电衰减反应，并与对照组鼠比较。结果模型组大鼠在第1次强化免疫后逐渐出现肌无力症状，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次加强免疫后上述症状明显加重。Lennon临床评分29只评分在1级以上，并行RNS检测，36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率>10%，而对照组衰减率均<10%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。结论皮下注射鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段可成功制作实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型。 【关键词】 重症肌无力; 乙酰胆碱受体; 亚基; 肽段 重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是乙酞胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的、细胞免疫依赖和补体参与的一种自身免疫性疾病，病变主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体，导致神经肌肉接头处传递功能障碍。 用从电鳗电器官中提取的AchR作为免疫原主动免疫易感鼠来建立EAMG模型，这是经典的造模方法。电鳗的电器官中含有丰富的AchR，但不足之处是电鳗难以捕获且提纯过程复杂，代价昂贵，限制了该法的大规模应用。 本研究采用鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段作为免疫原接种Lewis大鼠，制作EAMG模型，观察大鼠肌无力的变化，为研究重症肌无力的发病机制和治疗提供一种较好的实验动物模型。 1 材料 1.1 动物SPF级8周龄的Lewis大鼠45只，雌性，平均体重(155.2415.77)g，在自然环境条件下饲养;由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号码：SCXK-(京)2007-0001。随机取6只作为对照组(A组)，剩余大鼠进行EAMG造模，第6周末，造模大鼠还剩36只，经肌电图检测后，确定成模32只。再将其随机分为模型组、强的松组、健脾祛湿方高剂量组(相当于成人剂量的16倍)、健脾祛湿方低剂量组(相当于成人剂量的8倍)，分别为B、C、D、E组，每组各8只，共5组。 1.2 试剂鼠源性AchR-亚基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR subunit,R97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由西安美联生物技术有限公司合成。 完全福氏佐剂(complete freunds adjuvant，CFA)、不完全福氏佐剂(incomplete freunds adjuvant，IFA)、磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)均购自美国Sigma公司;新斯的明、阿托品均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供。 2 方法 2.1 EAMG模型建立本实验造模方法参考Baggi等1和许文华等2的制备方法复制EAMG模型。具体方法：首先将R97-116、CFA、PBS三者按11.51.5的比例充分混匀制成免疫乳剂;首次免疫：取乳剂200 l(含R97-116100 g)于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，对照组皮下注射等量PBS;首次免疫后30 d及45 d，将R97-116、IFA、PBS三者按133的比例充分混匀制成免疫乳剂后，再取乳剂200 l(含R97-11650 g)强化接种，对照组同样注射等量PBS。 2.2 模型评估标准 2.2.1 临床评估临床评估：通过测量体重和肌力来评价疾病严重性。实验前及接种后每周2次称重。末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况。测量肌力(对于轻度肌无力者给予疲劳试验即让鼠重复抓握笼顶30 s再测量)：采用Lennon等3的分级法予以临床评分;肌力具体分级为：0级：没有肯定的肌无力表现;1级：撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少，且容易疲劳;2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓握力弱;3级，在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握、濒死状态;4级，死亡。动物症状在以上4者之间可分别以0.5，1.5，2.5计分。结果以每个时间点的平均数表示。 2.2.2 新斯的明试验4用腹腔注射法给予新斯的明(37.5 g/kg)和硫酸阿托品(15 g/kg)，12 min后大鼠肌无力症状可缓解，持续212 h。 2.2.3 RNS检测电衰减反应5,6以10%的水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉后，将鼠仰卧固定在泡沫垫上。将刺激电极插入坐骨神经附近肌肉内，参考电极插入腹部皮下，记录电极一根置于同侧腓肠肌内侧头， 另一根插入跟腱部皮下，给予5 Hz连续10次的低频电刺激，将第1与第5个动作电位的变化百分比作为衰减值D，衰减率大于10%者为阳性。 3 结果 3.1 一般情况从第1次开始免疫后，造模大鼠约1月后才逐渐开始出现症状，如活动减少，动作减慢，抓持时挣扎力量减弱，叫声降低或短促，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次免疫后上述症状加重。最后共死亡3只，其中2只因肌无力症状过重而死亡，1只因皮下注射点出血，被同笼其它大鼠咬伤致死。 3.2 造模期间大鼠体重变化情况开始造模后，对照组大鼠体重保持稳定的增长趋势，而模型组体重增长较慢，且在加强免疫后体重出现下降，特别是在第6周再次加强免疫后体重出现明显的下降趋势。结果见图1。图1 造模期间EAMG大鼠体重变化 3.3 造模期间大鼠Lennon评分分级变化情况模型组实验鼠大多在初次免疫4周后出现较明显的肌无力，Lennon临床评分达0.51级，且随着时间的延长肌无力症状愈加显著，至造模结束时临床评分在1级以上者占造模鼠的78.38%。而对照组仅有个别在初期出现可疑的肌无力表现，至造模结束时评分均为0级。结果见图2。图2 造模期间EAMG大鼠Lennon评分变化 3.4 末次免疫2周后RNS检测结果应用5Hz连续10次的低频电刺激检测36只造模实验鼠，共有32只大鼠第1与第5个电位的衰减百分比超过10%，平均为(20.424.45)，其余4只大鼠的电衰减率小于10%，而对照组最大衰减均不超过10%。结果见表1及图3、4。表1 两组应用5Hz重复电刺激电衰减率比较图3 正常鼠电衰减图图4 成模鼠电衰减图x 【摘要】 目的研究用乙酰胆碱受体亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型。方法给实验组Lewis鼠皮下注射人工合成的鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段，观察接种后大鼠一般情况及体重、Lennon评分变化，应用低频重复电刺激检测电衰减反应，并与对照组鼠比较。结果模型组大鼠在第1次强化免疫后逐渐出现肌无力症状，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次加强免疫后上述症状明显加重。Lennon临床评分29只评分在1级以上，并行RNS检测，36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率>10%，而对照组衰减率均<10%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。结论皮下注射鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段可成功制作实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型。 【关键词】 重症肌无力; 乙酰胆碱受体; 亚基; 肽段 重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是乙酞胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的、细胞免疫依赖和补体参与的一种自身免疫性疾病，病变主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体，导致神经肌肉接头处传递功能障碍。 用从电鳗电器官中提取的AchR作为免疫原主动免疫易感鼠来建立EAMG模型，这是经典的造模方法。电鳗的电器官中含有丰富的AchR，但不足之处是电鳗难以捕获且提纯过程复杂，代价昂贵，限制了该法的大规模应用。 本研究采用鼠源性乙酰胆碱受体亚基97-116肽段作为免疫原接种Lewis大鼠，制作EAMG模型，观察大鼠肌无力的变化，为研究重症肌无力的发病机制和治疗提供一种较好的实验动物模型。 1 材料 1.1 动物SPF级8周龄的Lewis大鼠45只，雌性，平均体重(155.2415.77)g，在自然环境条件下饲养;由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号码：SCXK-(京)2007-0001。随机取6只作为对照组(A组)，剩余大鼠进行EAMG造模，第6周末，造模大鼠还剩36只，经肌电图检测后，确定成模32只。再将其随机分为模型组、强的松组、健脾祛湿方高剂量组(相当于成人剂量的16倍)、健脾祛湿方低剂量组(相当于成人剂量的8倍)，分别为B、C、D、E组，每组各8只，共5组。 1.2 试剂鼠源性AchR-亚基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR subunit,R97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由西安美联生物技术有限公司合成。 完全福氏佐剂(complete freunds adjuvant，CFA)、不完全福氏佐剂(incomplete freunds adjuvant，IFA)、磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)均购自美国Sigma公司;新斯的明、阿托品均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供。 2 方法 2.1 EAMG模型建立本实验造模方法参考Baggi等1和许文华等2的制备方法复制EAMG模型。具体方法：首先将R97-116、CFA、PBS三者按11.51.5的比例充分混匀制成免疫乳剂;首次免疫：取乳剂200 l(含R97-116100 g)于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，对照组皮下注射等量PBS;首次免疫后30 d及45 d，将R97-116、IFA、PBS三者按133的比例充分混匀制成免疫乳剂后，再取乳剂200 l(含R97-11650 g)强化接种，对照组同样注射等量PBS。 2.2 模型评估标准 2.2.1 临床评估临床评估：通过测量体重和肌力来评价疾病严重性。实验前及接种后每周2次称重。末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况。测量肌力(对于轻度肌无力者给予疲劳试验即让鼠重复抓握笼顶30 s再测量)：采用Lennon等3的分级法予以临床评分;肌力具体分级为：0级：没有肯定的肌无力表现;1级：撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少，且容易疲劳;2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓握力弱;3级，在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握、濒死状态;4级，死亡。动物症状在以上4者之间可分别以0.5，1.5，2.5计分。结果以每个时间点的平均数表示。 2.2.2 新斯的明试验4用腹腔注射法给予新斯的明(37.5 g/kg)和硫酸阿托品(15 g/kg)，12 min后大鼠肌无力症状可缓解，持续212 h。 2.2.3 RNS检测电衰减反应5,6以10%的水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉后，将鼠仰卧固定在泡沫垫上。将刺激电极插入坐骨神经附近肌肉内，参考电极插入腹部皮下，记录电极一根置于同侧腓肠肌内侧头， 另一根插入跟腱部皮下，给予5 Hz连续10次的低频电刺激，将第1与第5个动作电位的变化百分比作为衰减值D，衰减率大于10%者为阳性。 3 结果 3.1 一般情况从第1次开始免疫后，造模大鼠约1月后才逐渐开始出现症状，如活动减少，动作减慢，抓持时挣扎力量减弱，叫声降低或短促，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次免疫后上述症状加重。最后共死亡3只，其中2只因肌无力症状过重而死亡，1只因皮下注射点出血，被同笼其它大鼠咬伤致死。 3.2 造模期间大鼠体重变化情况开始造模后，对照组大鼠体重保持稳定的增长趋势，而模型组体重增长较慢，且在加强免疫后体重出现下降，特别是在第6周再次加强免疫后体重出现明显的下降趋势。结果见图1。图1 造模期间EAMG大鼠体重变化 3.3 造模期间大鼠Lennon评分分级变化情况模型组实验鼠大多在初次免疫4周后出现较明显的肌无力，Lennon临床评分达0.51级，且随着时间的延长肌无力症状愈加显著，至造模结束时临床评分在1级以上者占造模鼠的78.38%。而对照组仅有个别在初期出现可疑的肌无力表现，至造模结束时评分均为0级。结果见图2。图2 造模期间EAMG大鼠Lennon评分变化 3.4 末次免疫2周后RNS检测结果应用5Hz连续10次的低频电刺激检测36只造模实验鼠，共有32只大鼠第1与第5个电位的衰减百分比超过10%，平均为(20.424.45)，其余4只大鼠的电衰减率小于10%，而对照组最大衰减均不超过10%。结果见表1及图3、4。表1 两组应用5Hz重复电刺激电衰减率比较图3 正常鼠电衰减图图4 成模鼠电衰减图 3.5 药物干预前各组的体重、Lennon临床评分比较造模成功后，成模的32只大鼠随机分为模型组(B)、强的松组(C)、中药高剂量组(D)、中药低剂量组(E)第4组。各组体重、Lennon评分均无显著性差异(P>0.05)。结果见表2。表2 给药前各组的平均体重及Lennon评分的比较 4 讨论 目前EAMG模型大多是根据“AchR-Ab致病机制”的理论来复制的，其原理就是利用AchR作为自身免疫原，注射到动物体内，诱导动物如Lewis大鼠产生AchR-Ab，使NMJ处的AchR受到破坏，产生肌无力后获得EAMG。 天然的AchR包含多个抗原决定簇，具有良好的免疫原性，能够有效激活宿主的免疫系统，如利用电鳗的电器官中提取的AchR来免疫接种动物致EAMG动物模型已经是一种较为成熟的方法7。但缺点是想要获得足够量纯化的AchR较为困难。一方面哺乳动物骨骼肌中AchR含量极少，提取困难;另一方面，虽然在电鳗的电器官中AchR含量丰富，但电鳗不易捕获，加上其AchR提纯过程复杂而昂贵，因此限制了该法的推广应用。 有研究8发现MG的发生也可能与病毒感染等因素诱导胸腺过度表达AchR亚单位有关。目前一般认为：AchR的抗原决定簇主要分布在亚基上。亚基是AchR的主要生物学功能单位，具有高度的免疫原性，刺激亚基或亚基的某些肽段，可以激活特异性AchR反应性T细胞从而产生机体免疫反应9,10。T细胞能否特异性地识别蛋白质或者多肽，在于其线性决定簇，即蛋白质或多肽的氨基酸一级序列，对多肽的空间结构没有严格的要求，因此采用人工合成的多肽作为免疫原免疫动物诱导EAMG，只需将其序列合成出来，而无需模拟多肽的二级或三级空间结构，这在目前来说是可行的。不少研究者已经作了成功的尝试：以AchR的亚基片段作为有效免疫原来制作EAMG模型。早在20世纪80年代，Lennon等11,12用人工合成的人、或电鳗的AchR的亚基125147肽段成功制作EAMG模型，但都存在不足之处，或者阳性率偏低(10%)，或者肌无力症状轻而短暂。近年来，Baggi等1,13发现应用同源性肽段免疫动物效果更好，他们以鼠源性AchR的亚基97-116免疫Lewis大鼠诱导EAMG模型，阳性率达73.3%，而且他们的实验发现应用人工合成的电鳗源性AchR的亚基肽段并不能诱导产生EAMG。国内学者许文华等2、吴怀国等14、杨丽等15亦做了相关的研究，其模型成功率分别为75.0%，91.7%，100.0%。 本研究参照国内外成功的研究经验，采用人工合成的鼠源性AchR的亚基97-116多肽(R97-116)作为免疫原免疫Lewis大鼠来制作EAMG模型，设正常对照组6只，模型组39只。实验结果显示，模型组大鼠在第1次强化免疫后(约35 d后)逐渐出现动作减慢，抓持时挣扎力量减弱，叫声降低或短促等肌无力表现，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次加强免疫后(约42 d后)上述症状明显加重。造模期间造模鼠中共死亡3只，其中2只因肌无力症状过重而死亡，1只因皮下注射点出血，被同笼其它大鼠咬伤而致死，而对照组无死亡。至8周后造模结束时，行Lennon临床评分29只评分在1级以上，并行RNS检测，36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率>10%，而对照组衰减率均<10%，证实EAMG模型建立，成功率达87.18%，与文献报道相似。本研究结果表明：以人工合成的R97-116肽段诱导EAMG模型是可行的，而且该方法相对简单、成本相对较低、免疫原充足、成模率较高，可以为MG的基础和临床研究创造必要的实验条件。 【参考文献】 1 Baggi F，Annoni A，Ubiali F，et al. Breakdown of tolerance to a self-peptide of acetylcholine receptor -subunit induces experimental myasthenia gravis in ratsJ. J of immunology，2004，172:2697.2 许文华，韩莹莹，汪思应，等.鼠源乙酰胆碱受体亚基97-116肽段免疫Lewis鼠诱导实验性重症肌无力模型J.中国神经精神疾病杂志，2006，32(2):179.3 Lennon VL，Lindstrom JM，Seybold ME. Experimental autoimmune myasthenia: a model of myasthenia gravis rats and guinea pigsJ. J Exp Med，1975，141 (6): 1365.4 Deng C，Goluszko E，Tuzun E，et al.Resistance to experimental autoimmune myasthenia gravis in IL-6-dificient mice is associated with reduced germinal center formation and C3 productionJ.J Immunol，2002，169(2):1077.5 Sanders DB，Schleifer LS，Eldefrawi ME，et al. An immunologically induced defect of neuromuscular transmission in rats and rabbitsJ. Ann NY Acad Sci，1976，274: 319.6 王云甫，孙圣刚，曹学兵，等.实验性重症肌无力大鼠模型研究J.中国神经免疫学和神经病学杂志，2003，10(4):242.7 Christadoss P，Poussin M，Deng C.Animal models of myasthenia gravisJ.Clin Immunol，2000，94:75.8 景 筠，贾建平，马 山，等.重症肌无力患者胸腺乙酰胆碱受体亚单位基因的表达J.中华神经科杂志，2005，38(5):322.9 Tzartos SJ，Barkas T，Cung MT，et al.Anatomy of the antigenic structure of a large membrane antigen， the muscle-type nicotinie acytylcholine recep