人类结肠癌裸鼠移植瘤模型制作及临床15TMR成像仪的1H-MRS研究.docVIP

精品论文，值得推荐人类结肠癌裸鼠移植瘤模型制作及临床1.5TMR成像仪的1H-MRS研究 【摘要】 目的 探索临床医用1.5T MR成像仪对人类结肠癌荷瘤裸鼠模型行常规MR成像及氢质子MR频谱（1H-MR spectroscopy，1H-MRS）分析的可能性。 方法 人类结肠癌SW480肿瘤块种植于25只麻醉状态下的裸鼠皮下制成结肠癌异位移植瘤裸鼠模型。给予荷瘤鼠行MR T1WI、T2WI、1H-MRS扫描，并与病理所见对比。 结果 25只裸鼠均成瘤。T2WI图像均能清晰显示肿瘤，肿瘤T1WI信号与肌肉等，T2WI为高信号，中央坏死区为更高信号。18只鼠MRS单体素采集成功，22只二维多体素采集成功，25只三维多体素采集成功。 结论 临床医用1.5TMR与临床医用线圈对人类结肠癌裸鼠模型可行1H-MRS研究，常规MRI T2WI图像可反映移植瘤的病理改变，研究结果更容易反映临床人类疾病的特点。 【关键词】 裸鼠 新生物 结肠 磁共振成像 氢质子MR频谱 Abstract Objective To investigate the feasibility of MR T1WI, T2WI and 1H-MR spectroscopy（1H-MRS）with clinical 1.5T scanner in vivo in a xenotransplant nude mouse model with human colon carcinoma. Methods The tumor pieces of human colon cancer SW480 were implanted subcutaneously in 25 nude mice. These mice were scanned with TSE-T1WI, T2WI and 1H-MRS and MR images were compared with histopathological findings. Results The subcutaneous tumors grew in 25 mice. All tumors were detected clearly on T2WI images, and shown as iso-intensity as muscle on T1WI and hyper-intensity on T2WI in which more hyper-intensity in necrotic areas. 1H-MRS were satisfactory for 18 mice with single voxel, 22 mice with 2-demensional multi voxel and 25 mice with 3-demensional multi voxel. Conclusion A xenotransplant nude mouse model with human colon carcinoma can be investigated with 1H-MRS at a clinic 1.5T scanner. MR images on T2WI correlated well with pathology findings, and may be advantages for easier extrapolation of the result to clinical human studies. Key words nude mouse; neoplasm; colon; magnetic resonance imaging; 1H-MR spectroscopy MR波谱分析（MR spectroscopy，MRS）是目前唯一活体无创显示肿瘤代谢的方法，用动物模型充分开发其潜能、探索MRS在肿瘤诊断、新的治疗药物的无创性疗效监测中的作用有重要实用价值。目前裸鼠模型的MRS采用高场或极高场（4.7T-8.5T）的小动物专用成像仪与动物专用线圈13。但小动物专用MR成像仪稀少, 难于满足日益增多的实验研究。因此，有必要探索采用临床医用MR成像设备行小鼠模型的1H-MRS的研究。 材料与方法 1. 动物模型制作 人类结肠癌SW480细胞株（p53突变型）购自中国科学院上海细胞库。常规细胞培养，取对数生长期细胞制成细胞浓度为1107/ml细胞悬液。 BALB/c裸小鼠购自中山大学动物实验部，体重213g，雌雄不限，养殖于中山大学动物实验部SPF级实验室。取两只裸鼠，用安尔碘上背部皮肤消毒，将制成的SW480细胞悬液取0.5ml注射至2只裸鼠胁部皮下，10d后肿瘤生长至1.21.6cm。小鼠在麻醉状态下（4.5%水合氯醛2ml/100g腹腔注射）切取肿瘤块并切成12mm3小块作为移植瘤材。 取外表健康裸鼠25只，麻醉方法同上，用安尔碘鼠下半身皮肤消毒，切开大腿根背部皮肤，分离皮下疏松组织，通过自制的植入管缓慢推入肿瘤组织块，缝合皮肤，安尔碘消毒伤口，小鼠保暖复苏后自由进食、进水。定期观察肿瘤生长情况。 2.荷瘤鼠MR检查 上述荷瘤鼠于种瘤后37天-42天，同上方法麻醉后，用Philips Gyroscan Intera Achieva1.5T Ivova Dual HP超导型MR成像仪、膝关节8通道相控阵线圈（Syn-keen-8）行以下序列成像。 2.1 T1WI快速自旋回波（TSE）序列 TR/TE= 444ms/13ms， NAS=4，TSE加速因子=4，行轴位成像，成像时间=1min22.5s；T2WI快速自旋回波（TSE）：TR/TE=2600ms/100ms，层厚=2mm，间隔=0，FOV=120mm，NAS=6，SENSE加速因子=2，采集矩阵=180136，重建矩阵=224224，行轴位、冠状、矢状位成像，成像时间=1min05s。 2.2 磁共振频谱分析（Magnetic resonance spectrograhy，MRS） 采用以下三种模式采集，均采用PRESS序列，谱线带宽1000Hz，翻转角=90，采集MRS数据前均自动匀场、抑水。 （1）单体素容积采集（single voxel，SV）：TR/TE=2000ms/288ms，层厚=2mm，FOV=100mm，VOI=1012mm，NAS128，采集矩阵=180136，重建矩阵=224224，采集时间=4min56s。 （2）多体素2维容积采集（2-demensional multi voxel, 2DMV）：TR/TE=1312ms/288ms，层厚=2mm，间隔=0，FOV=100mm，NAS=6，采集矩阵=180136，重建矩阵=224224，成像时间=4min08s。 （3）多体素3维容积采集（3- demensional multi voxel, 3DMV）：TR/TE=1312ms/288ms，层厚=10mm20mm（根据肿瘤大小调整），间隔=0，FOV=100mm，VOI=1015mm，采集体素边长8mm， NAS=6，采集矩阵=180136，重建矩阵=224224，成像时间=12min54.1s。 3. 肿瘤标本的病理检测 荷瘤鼠完成上述检查后，测量肿瘤大小后腹腔注射常规麻醉量5倍的水合氯醛处死，完整取出肿瘤，将肿瘤以成像轴位最大径线处对半切开，用4%BPS缓冲福尔马林固定液固定，常规石蜡完全包埋（最大切面向外），4m连续切片，行常规病理HE染色，二步法免疫组织化学检测p53。 4. 资料收集 4.1 MR成像资料收集 肿瘤最大横切面上最小经线1.0cm的样本数据被纳入分析。采集的数据利用磁共振成像仪自带后处理软件处理。在2DMV、3DMV模式采集的图上取能最大范围覆盖肿瘤的采集体素，SV以实际采集体素，自动拟和出MRS曲线，自动计算出所测代谢物的峰高、波峰下面积及与肌酸（creatine，Cr）的峰高比值和波峰下面积比值（图1）。所测得代谢物有胆碱（choline，Cho）、Cr、谷氨酸（Glutamine，GLX）、脂质（lipine，Lip）。 4.2 标本资料收集 病理切片：由两位有经验的病理科医师分别按预先拟定的标准在光学显微镜下阅片分析，取两者采集的均数值为病理检测结果。 P53染色阳性细胞为细胞核呈棕黄色颗粒，在100倍视野观察并估算切片内的肿瘤细胞阳性细胞数，并计算p53指数（p53 index，p53I）：p53I = p53染色的阳性细胞数/肿瘤细胞数100%。10%为“-”，10%25%为“”，>25%为“”，>50%为“”，>75%为“”。 5. 统计学处理 所得数据输入SPSS13.0版软件中建立数据库计算分析，两两比较采用Wilcoxon检验。将P<0.05设为差异有统计学意义。 结 果 1. 接种成功情况与动物生存 25只裸鼠模型制作费时2h，无裸鼠因接种手术而死亡，种植后37天42天均在皮下形成最大经线0.76cm1.81cm的肿瘤块（图），5w时4只荷瘤鼠消瘦。检查结束无荷瘤鼠死亡。 2. MR表现 2.1 常规MR成像 荷瘤鼠皮下肿瘤在常规MR图像上，T1WI为等信号（图3A），T2WI为不均匀高信号，中央部位呈更高信号（图3B-3C），HE切片上肿瘤内可见坏死区(图4A)，可见印戒样细胞与腺管状结构(图4B)；免疫组化染色p53(图4C)。 2.2 MRS 25只鼠，SV采集成功18只，MV-2D采集成功22只，MV-3D采集成功25只。对肿瘤最小经线1.2cm的18只鼠数据进行后处理分析，结果见表1-2。 两两比较采用Wilcoxon检验，SV检测各代谢物量与2DMV检测差别无显著性（p0.12731.000），3DMV检测代谢物量与SV、2DMV差别有显著性（p0.00020.0434；p0.00770.0341）。 讨 论 1. 关于结肠癌荷瘤裸鼠模型的制作 目前，常用于建立结肠癌移植瘤动物模型的方法包括细胞移植和组织移植，根据部位的不同，又可分为皮下移植4、肝脏移植5和原位移植6。其中，通过将结肠癌细胞接种于免疫缺陷动物皮下所建立的皮下移植瘤模型，是应用得最早和最为广泛的，它具有操作简单、成瘤率高，便于观察肿瘤的发生、生长情况等优点，方便直接给药，广泛用于生物治疗和基因治疗的临床前期研究，有利于影像成像观察4。本组采用组织移植方式，用人类结肠癌SW480细胞株自制移植瘤株，制作皮下移植瘤裸鼠模型，在移植后37天42天，肿瘤长至0.76cm1.81cm，4只荷瘤鼠轻度消瘦，所形成的肿瘤均可行MR成像观察。 在国外，无论是动物专用MR成像仪还是临床医用型MR成像仪对荷瘤裸鼠成像，均采用的是动物专用线圈710。荷瘤鼠肿瘤在MR常规T1WI、T2WI上呈长T1、长T2改变7，T2WI图像上肿瘤与周围结构分界清，可活体评价肿瘤容积，并与组织容积有很好的相关性7。常规T1WI、T2WI能显示小鼠肿瘤的解剖细节，也成为MR分子靶向成像8和动态增强的基本序列9。有研究者采用临床医用腕关节线圈在临床医用型1.5TMR成像议上对横纹肌肉瘤肝脏荷瘤大鼠行MR成像，得到了良好的图像质量，T2WI上可显示肿瘤均值、罕有坏死的病理特点10。与动物专用机相比，MR图像的质量相对较差。 本研究采用8通道的临床医用膝关节线圈在临床医用1.5TMR成像仪对小鼠皮下移植瘤模型成像,T1WI、T2WI成像时间短，图像分辨率高。人类结肠癌SW480荷瘤鼠肿瘤在MRI T1WI信号与肌肉信号接近，T2WI呈高信号，肿瘤内常可见更高信号，后者在病理检查显示为肿瘤灶内坏死，在横断、冠状、矢状位上，肿瘤和周围组织结构的解剖关系可清晰显示。 2. 关于荷瘤鼠的MRS 1H-MRS能采集肿瘤与正常组织生物化学的信息1112，也是临床前期用动物模型研究人类肿瘤代谢的最常用方法13。 核磁共振可进行单体素、多体素MRS采集，1H-MRS要求达到接受的信噪比的组织容积在高场的动物扫描仪以几微升计，在人的MR成像仪以毫升计1。小体形的小鼠绝大多数用小动物专用机进行MRS采集。单体素频谱成像比多体素成像空间分辨率低，多体素用多个单体素同时覆盖多个区域，同时对肿瘤和周围正常组织的代谢分布状况进行研究。但多体素较单体素在优化和采集费时长13-14。 频谱质量依赖于采集体素的大小，频谱的信噪比随体素呈线性增加，随采集次数平方根呈线性增加14。为获得可接受的采集时间内的最大的信噪比，选择尽可能多的采集次数。此外，MRS采集场均匀性要求更高，同时被检体尽量在静止状态，小鼠的呼吸频率高，会给采集带来很大影响15。 基于各种影响因素，本研究在采用临床医用型1.5TMR成像议与8通道的临床医用膝关节线圈对荷瘤裸鼠肿瘤行MRS采集时，用自制的外固定物增加被检体占空比同时，基本消除呼吸运动的影响，匀场时要求F0绝对居中，在原推荐扫描参数基础上适当增加采集次数，采集容积1ml，结果10只荷瘤鼠SV采集成功7只，MV-2D采集成功9只，MV-3D采集成功10只，所得谱线能获得胆碱（Cho）、肌酸（Cr）、脂类（lip）、谷氨酰胺和谷氨酸复合物（Glx）波峰。SV、2DMV所得代谢物的峰高与面积明显低于3DMV，说明3DMV检测代谢物的敏感性高于SV，与Chernov等13研究发现3DMV比SV对脑转移瘤伽马刀治疗后更敏感显示肿瘤代谢改变的结果一致。 本研究用人类结肠癌SW480细胞株自制组织移植瘤株，制作皮下移植瘤裸鼠模型，移植材料具备恶性肿瘤原有的组织结构，肿瘤细胞之间的协同性好，最大限度的保持了恶性肿瘤的生物学表象和自然属性，所形成的肿瘤均可行MR成像观察。快速的T1WI、T2WI成像时间短，图像分辨率高，可无创活体评价移植瘤的病理特征提供可靠的信息；可对肿瘤行MRS采集，因此，缺乏动物专用小型MR成像仪不应该成为利用裸鼠模型行新的抗癌药（基因）临床试验与临床前期实验的障碍。 【参考文献】 1. 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