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生防菌JK-2胞外多糖提取条件优化及其对病原菌的抑制作用研究张秋芳，刘 波*，史 怀，肖荣凤，官雪芳，葛慈斌，郝晓娟，王秋红（福建省农科院生物技术研究所，福建 福州 350003）摘 要细菌胞外多糖（Exotracelluar polysaccharide，EPS），是指细菌在生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或夹膜多糖，其成分和结构复杂，常具有调节和增强免疫功能、具抗肿瘤、抗感染、抗炎等多种功效。本课题组筛选到的拮抗菌株JK-2具有抑菌效果,且已有研究表明，其发酵液可作为番茄枯萎病菌等抑制作用的活性指标，而多糖即是发酵液的主要成分之一。为此，我们对JK-2菌株发酵液中的胞外糖提取与分离条件进行了优化研究，并将提取过程各阶段所获得物质对病原菌的抑制效应进行了初步测定。主要研究内容：（1）分别采用正交试验对提取液中的小分子核酸（低浓度乙醇法）和蛋白质（Sevag方法）的去除条件进行优化，并将去除蛋白质后的提取液经透析后过不同规格凝胶柱，所得的高含糖量收集管的层析液用薄层层析（TLC）进行多糖成分的初步测定；（2）将提取过程中的各阶段所得物对本试验室已有的一些病原菌进行抑制效应测定。试验结果，生防菌JK-2的胞外多糖提取纯化的优化条件为（按试验过程的先后顺序）：（1）小分子核酸的去除：加3倍于待提取液体积、浓度为25%的乙醇做为沉淀剂，离心速率为13000rpm，离心时间为16min后去除沉淀物，得上清液；（2）粗糖液的制备：添加3倍体积的80%乙醇溶液（最终乙醇浓度为60%）于去除核酸的提取液中，离心得沉淀物，并将溶于水中；（3）蛋白质的去除：氯仿与正丁醇体积比为2：1、提取次数为4 次、每次振摇时间为10min，粗提液与提取剂的体积比为1：2；（4）透析纯化：于10cm 透析袋（袋孔直径2.1cm,可透过分子量为6,000Da）中，将去除蛋白质后的提取液透析96h；（5）柱层析分离：分别将透析后的提取液用Sephacryl S-200和Superdex-75的凝胶柱进行分离，皆出现明显的单峰；用紫外分光光度计光谱扫描，在260nm和280nm波长下其值接近为零；根据凝胶柱的标准品曲线，初步可得多糖分子量为7.868104Da；(6)TLC分析：将提取经酸水解后分析进行TLC分析，多糖水解液中初步可确定含有单糖D（+）木糖。上述各阶段所得物质对本试验室分离到的病原菌的抑制效果:（1）对于从甜瓜、西瓜、辣椒、蕃茄和香蕉中分离到的镰刀菌，其抑制效果大小为：未去除蛋白质的溶液抑制效果较明显大于透析前粗糖溶液和透析后过层析柱前粗糖溶液,而后两者的效果相当；（2）不同阶段的提取物对强、弱致病力青枯菌的抑制效果不同。 关键词：胞外多糖；生防菌JK-2；提取条件；优化；抑菌活性作者简介：张秋芳，女，硕士，副研究员，主要从事植物营养生理及生化物质分析等方面研究。E-mail: qfzhang1
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