《基因工程制药》doc版.doc

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概述生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等）以及某些疫苗，由于材料来源困难或制造技术问题而无法研制出产品，即使应用传统技术从动物器官中提取出来，也因为造价太高而使患者负担不起。而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面中取得明显效果，它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽：免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体；细胞因子，干扰素、白介素、生长因子；激素，胰岛素、生长激素；酶类，尿激酶、链激酶超氧化物歧化酶。利用基因工程技术生产药物的优点：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第二节 基因工程药物生产的基本过程基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆；构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因，构建工程菌，主要在实验室完成。下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。制备基因工程药物的一般程序：获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装基因的表达系统有原核生物系统和真核生物生物系统。选择表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达量的多少和分离纯化的难易。下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。 第三节 目的基因的获得对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难，另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA 转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA 也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。克隆真核基因常用的方法有逆转录法和和学合成法。一、逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA，再以互补DNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA序列，该序列不含内含子。1、mRNA的纯化细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。2、互补DNA第一链的合成mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。3、互补DNA第二条链的合成先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。4、互补DNA克隆载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译 合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。互补DNA插入片段小于10千碱基对，可选用质粒载体，如大于10千碱基对则选用噬菌体作为载体。二、化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成，其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。人工化学合成的限制：1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。第四节 基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。进行基因表达，我们所关心的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性，产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。一、宿主细胞的选择宿主细胞应满足以下要求：1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。宿主可分为两大类：原核细胞大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；真核细胞酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。1、原核细胞（1）、大肠杆菌生长迅速、对其研究比较深入，所以常用，特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。限制：没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，提取时需破碎细胞，这样细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难，由于分泌力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。（2）、枯草芽孢杆菌分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体，但该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解。（3）、链霉菌主要特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。2、真核细胞（1）、酵母特点：是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。繁殖迅速、可以廉价地大规模培养，没有毒性。能将表达产物直接分泌到胞外，表达产物能糖基化。（2）、丝状真菌特点：有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，而且糖基化方式与高等真核生物相似。（3）、哺乳动物细胞特点：产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易，表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物；动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。二、大肠杆菌中的基因表达1、载体根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：（1）、载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）；松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个。（2）、应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。（3）、应具有很强的启动子，能为达成杆菌的RNA聚合酶所识别。（4）、应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。（5）、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。（6）、所产生的mRNA必须有翻译的其始信号。2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物。（1）、外源基因的拷贝数外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。（2）、外源基因的表达效率启动子的强度在转录水平上直接影响基因的表达、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达。（3）、表达产物的稳定性表达的外源基因，其产物会受到宿主细胞内降解该蛋白质的酶的作用，使得实际产量很低。可采用下列方法来提高表达产物的稳定性：组建融合基因，产生融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。（4）、细胞的代谢负荷外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可以采取当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表达。即将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常生长，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷；另外，将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。（5）、工程菌的培养条件优化培养条件使外源基因大量表达。3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式三种：融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。（1）、融合蛋白融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。优点：基因操作简便、蛋白质在菌体内比较稳定、不易被细菌酶类所降解、容易实现高效表达。缺点：只能做抗原作用，原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成两个多肽链。（2）、非融合蛋白表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子细菌的核糖体结合位点真核基因的起始密码子结构基因终止密码。要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适，稍有不适就会影响表达效率。优点：能够较好地保持原来的蛋白活性；缺点：容易被蛋白酶破坏，氨基末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起人体免疫反应。（3）、分泌型将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。特点：一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的甲硫氨酸。产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。三、酵母中的基因表达1、载体酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中。酵母载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求。精确表达载体，要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1）、外源基因的拷贝数拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达。（2）、外源基因的表达效率与启动子、分泌信号、终止序列有关。要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母军表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架。分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。 （3）、外源蛋白的糖基化外源蛋白在分泌过程中发生糖基化。（4）、宿主菌株的影响宿主菌株应具备下列要求：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要较弱；菌体性能稳定；分泌能力强。四、动物细胞中的基因表达动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物纯化比较容易，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物；但动物细胞生长慢，单位体积生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小。第五节 基因工程菌的稳定性基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定，分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象；质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒不稳定产生的原因常见的是分裂不稳定，与两个因素有关：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的比生长速率差异的大小。含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性。含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，因而对这类菌进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势。质粒稳定性的分析方法：将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10-12小时，然后随机挑出100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上，培养10-12小时，统计长出的菌落数，每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。二、提高质粒稳定性的方法采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。适当的操作方式也可使工程菌生长速率具有优势，调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。第六节 基因工程菌生长代谢的特点菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义。对菌体生长的调控主要有两种观点：能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；小分子前体和催化组分（RNA聚合酶、核糖体）的限制决定了菌体的最大比生长速率。这两种观点分别从能量和合成反应的前体这两个不同的角度研究菌体的生长。一、菌体生长与能量的关系菌体生长是由呼吸控制的，各种碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体在这种培养基中的最大比生长速率。当菌体生长所需能量超过菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。这些培养方法的实质是控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力。二、菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，使蛋白质合成增加。由于菌体中小分子前提量和催化结构是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。同样培养基当中，工程菌的比生长速率低于其宿主细胞。第七节 基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程主要包括：1、通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；2、通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。一、基因工程菌的培养方式1、补料分批培养将种子接入反应器中后，培养一段时间，然后间歇或连续补加新鲜培养基，使菌体进一步生长。为保持基因工程菌生长所需的良好环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生长规律来调节补料速率。2、连续培养将种子接入反应器后，培养一段时间，到一定菌浓，开动蠕动泵，同时进料和出料，控制一定稀释速率，由于基因工程菌不稳定，可将生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养，关键的控制参数是诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。3、透析培养利用膜的半透性使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4、固定化培养基因工程菌固定化后，质粒的稳定性大大提高。便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。二、基因工程菌的发酵工艺基因工程菌培养目的是为了使外源基因大量表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系，而且也其所处的环境也密切相关。不同的发酵条件，代谢途径也不相同，对下游的纯化工艺就会造成不同的影响。1、培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。使用不同的碳源对菌体生长和外源基因的表达有较大的影响，如葡萄糖做碳源菌体产生的副产物较多，甘油做碳源菌体得率较大。酪蛋白水解物做氮源有利于产物的合成与分泌。无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，在低磷浓度下，尽管最大菌浓较低，但产物产率和产物浓度都较高。启动子只有在低磷酸盐时才被启动。2、接种量的影响接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达；量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并使产生菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长。3、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成上。复制，可通过控制复制来改变基因拷贝数，影响基因的表达；转录，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达。酶促反应。4、溶解氧的影响菌体在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化分解代谢，采用调节搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。在发酵前期采用较低转速，即可满足菌体生长，在培养后期，提高搅拌转速才能满足菌体继续生长的要求。这样既节约能源又可满足各个不同阶段菌体生长的要求。5、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长期后期升温诱导表达，对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109个每毫升为止，这时菌群数目倍增，对营养和氧的需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。6、pH的影响两阶段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期着重于优化外源基因的表达，生长最佳期pH6.8-7.4，外源蛋白表达时pH 6.0-6.5。第九节 基因工程药物的质量控制基因工程药物的特点：用活细胞作为表达体系，所获得的蛋白质产品往往相对分子量较大，并有复杂的结构，许多药物是参与一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，所以任何药物在性质或剂量上的偏差，都可能造成严重的后果，从原料开始每一步都要进行严格的控制。一、原料的质量控制原料的质量控制是为了保证编码药品的DNA序列的正确性，以及产品质量的安全性和一致性。根据质量控制的要求，应了解下列特征：目的基因的来源、克隆的经过、并用限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等予以确证、应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组分（复制子、启动子）的来源与功能、构建中所用位点的酶切图谱、抗生素抗性标志物、提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性，需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体上及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后遗传稳定性，提供插入基因与表达载体俩侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞表达的方法与水平等。二、培养过程的质量控制储存中，要求种子克隆纯而稳定；培养中，工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，表达稳定；始终能排除外源微生物的污染。生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批需确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存以预计使用期，保存与复苏的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定在高允许传代数；培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。三、纯化工艺过程的质量控制要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质都在规定的限度以下。在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质。四、目标产品的质量控制药物质量控制包括以下要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。利用多学科的技术生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学。1、产品的鉴别肽图分析：用酶法和化学方法降解目的蛋白，对生成的肽段进行分离分析，检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。灵敏、高效。高效液相色谱和毛细管电泳。氨基酸成分分析：小于50个氨基酸分析结果较可靠。部分氨基酸序列分析：氨基端15个氨基酸。重组蛋白质的浓度测定和相对分子量测定：浓度，凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法。分子量，凝胶过滤法（完整）和SDS-PAGE法（亚基）。蛋白质二硫键分析：维持蛋白质一级结构的重要共价键。2、纯度分析包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析。（1）、目的蛋白，根据理化性质和生物学特性。常用还原性及非还原性SDS-PAGE、等电聚焦、各种高效液相、毛细管电泳等。应用两种以上方法。（2）杂质，包括蛋白质和非蛋白质杂质。蛋白类，宿主细胞蛋白，采用免疫方法和电泳相结合；非蛋白类，病毒、细菌等微生物、热源质、内毒素、致敏原及DNA。利用微生物学方法检测无菌。热源质检测用家兔注射。3、生物活性测定需要动物体内实验和通过细胞培养进行体外效价测定。重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。体内生物学活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型，体外生物活性测定有细胞计数法等。4、稳定性考察是评价药品要效性按安全性的重要指标，也是确定药品储藏条件和使用期限的主要依据。对温度、氧化、光照、离子浓度和机械剪切等环境因素都很敏感。5、产品一致性的保证生产周期长，影响因素多，必须对每一步都进行严格的控制。五、产品的保存目的产物受多种因素的影响而失活，保存时要防止变性、降解、保护活性中心。1、液态保存低温保存：对热敏感。在稳定pH条件下保存：防止变性。高浓度保存：高浓度时比较稳定。加保护剂保存：糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂等。有些需要加盐，加2-巯基乙醇在真空或惰性气体中保存。2、固体保存固体蛋白质比液体稳定，在室温或冰箱中保存比较稳定，长期保存最好制成干粉或结晶。第十节 基因工程药物制造实例干扰素（interferon IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据其结构可分为、等4个类型。干扰素又依其结构分为1b、2a、2b等亚型，其区别在于个别氨基酸的差异上，早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。一、基因工程菌的组建目的基因的获得：将生产干扰素的白细胞的mRNA分级分离，然后将不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母细胞，并测定合成干扰素的抗病毒活性，结果发现12SmRNA的活性最高，因此用这部分mRNA合成cDNA。将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化大肠杆菌K12，的几千个重组子克隆，每个克隆都用粗提的干扰素的mRNA去进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行翻译，对每一个翻译体系的产物进行抗病毒的干扰素活性检测，经过多轮筛选获得了产生干扰素的cDNA，最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌进行高效表达。二、基因工程干扰素的制备启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定成品包装1、 发酵人干扰素2b基因工程菌为SW-IFN-2b/E.coli DH5, PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因，种子培养基 含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠。分别接种人干扰素2b基因工程菌到4个装有250毫升种子培养基的1000毫升摇瓶中，30培养10小时，作为发酵罐种子，用15升发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10升，发酵培养基由1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.01%氯化铵、0.05%氯化钠、0.6%磷酸氢二钠、0.001%氯化钙、0.3%磷酸二氢钾0.01%硫酸镁、0.4%葡萄糖、50毫克每毫升氨苄青霉素、少量防泡剂组成，pH6.8。转速500转每分，通气量为1：1溶氧为50%。30发酵8小时，然后在42诱导2-3小时完成发酵。同时每隔不同时间取2毫升发酵液，10000转每分离心除去上清夜，称量菌体重量。2、产物的提取和纯化发酵完毕后，冷却，进行4000转每分离心，离心30分，得湿菌体1000克左右。取100克湿菌体重新悬浮于500毫升20毫摩尔每升磷酸缓冲液中（pH7.0），于冰浴条件下进行超声波破碎，然后4000转每分，离心30分，取沉淀部分，用100毫升含8摩尔每升尿素、20毫摩尔每升磷酸缓冲液（pH7.0）、0.5毫摩尔每升二巯基苏糖醇的溶液，室温搅拌抽提2小时，然后用15000转每分离心，30分，取上清夜，用20毫摩尔每升磷酸缓冲液（pH7.0）稀释至尿素浓度为0.5毫摩尔每升，加二巯基苏糖醇至0.1毫摩尔每升，4搅拌，15小时，15000转每分，离心30分除去不溶物。上清夜经截流量为10000相对分子量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素2b溶液经过Sephadex D50 分离，层析柱2厘米*100厘米，先用20毫摩尔每升磷酸缓冲液（pH7.0）平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素2b部分，经SDS-PAGE检查。将Sephadex D50柱分离的人干扰素2b组分，再经DE-52柱（2厘米*50厘米）纯化人干扰素2b组分，上柱后用含0.05、0.1、0.15摩尔每升氯化钠的20毫摩尔每升磷酸缓冲液（pH7.0）分别洗涤，收集含人干扰素2b的洗脱液。全过程蛋白回收率为20-25%，产品不含杂蛋白，DNA及热源含量合格。三、质量控制标准和要求1、半成品检定效价测定、蛋白质含量测定、活性测定、比活性测定、纯度测定、相对分子量测定、核酸含量测定、鼠IgG含量测定、等电点测定、无菌试验、热源质试验等。（1）、效价测定用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。（2）、蛋白质含量测定，福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。（3）、比活性，效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。（4）、纯度，电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。（5）、相对分子量测定，还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。（6）、残余外源性DNA含量测定，用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。（7）、残余血清IgG含量测定，在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。（8）、残余抗生素活性测定，半成品中不应有抗生素活性存在。（9）、紫外光谱扫描，检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280纳米加减2纳米。（10）、肽图测定， 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。（11）、等电点测定，等电聚焦电泳。（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。2、成品检定外观、活性、水分、无菌试验、安全毒性、热源质。（1）、物理性状，冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。（2）、鉴别试验，应用ELISA或中和试验检定。（3）、水分测定，用卡氏法，应低于3%。（4）、无菌试验，同半成品。（5）、热源质试验，同半成品检定。（6）、干扰素效价测定，同半成品检定，效价不应低于标示量。（7）、安全试验，取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。四、人胰岛素融合蛋白重组菌株的组建选Tac启动子，构建了以牛凝乳酶原B前161个氨基酸的多肽基因与人胰岛素原基因组成的融合基因的表达质粒pJG202，转化大肠杆菌JM105，表达受IPTG及温度诱导。高表达时，按电泳扫描计算，表达的融合蛋白可占细胞总蛋白的20-35%。经CNBr裂解，S-磺酸酸解，初步分离S-磺酸型的人胰岛素原后再使之重组，可分离得到人胰岛素原纯品，其氨基酸组成、生物活性与人胰岛素原标准相同。五、乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建将乙型肝炎表面抗原基因插入调控型启动子PH05的乳酸克鲁维表达载体中，构建完整质粒pLS1，转化宿主菌CXJ1-7A。为了进一步提高表达水平，将pLS1中的乙型肝炎表面抗原表达单元插入带完整pKD1序列的载体PE1，并将构建成的质粒pLS2转化MW98-8C。在比较了CXJ-7A/pLS1和MW98-8C/pLS2后，发现MW98-8C/pLS2的稳定性大大提高，表达量也增加了4-8倍。六、基因工程在抗生素生产中的应用1、提高抗生素产量工业使用的抗生素产生菌都是通过物理或化学方法诱变后得到的，如果利用基因工程技术有目的地定向改造基因，提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力效果会更好。可进行以下几方面的工作。（1）、将产生菌基因随即克隆到原株直接筛选高产菌在克隆菌株中，增加某一与产量有关的基因剂量，使产量得到提高。（2）、增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别位于合成途径中的限速瓶颈，并设法导入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，如果增加的中间产物不对合成途径中某个步骤产生反馈抑制，就有可能增加最终抗生素的产量。（3）、通过调节基因的作用调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，正调节基因可能通过一些正调控机制对结构基因进行正向调节，加速抗生素的产生，负调节基因可能通过一些负调控机制对结构基因进行负向调节，降低抗生素的产量，因此，增加正调节基因或降低副调节基因的作用，可增加抗生素的产量。（4）、增加抗性基因抗性基因可通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免受所产生的抗生素的杀灭作用，有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成，抗性基因经常和生物合成基因连锁，而且它们的转录有可能也是紧密相连的，是激活生物合成基因进行转录的必须成分。抗性基因必须首先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。抗生素的产生与菌种对其自身抗生素的抗性密切相关。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶和对自身抗性的酶所共同确定，这就为通过提高菌种自身抗性水平来改良菌种，提高抗生素产量提供了依据。2、改善抗生素组分许多抗生素产生菌可产生多组分抗生素，由于这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大，这给有效组分的发酵、提取和 精制带来了很大不便。随着对抗生素生物合成途径和深入了解及基因重组技术的不断发展，应用基因工程技术可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。3、改进抗生素生产工艺抗生素的合成一般对氧的