《生化基础法医学》PPT课件.pptVIP

第三章：,法医物证DNA分析 的生化基础 伍新尧,法医物证检验： 分析检材中的“个人特征” “遗传特征” (Genetic Characters) ， 群体/个体的关系“遗传多态性”的个人特征,遗传标记的分类,1. 蛋白质类： 糖蛋白RBC表面抗原 WBCHLA 血清蛋白型 同工酶型 结构蛋白外貌特征 2. 核酸类： DNA RNA(mRNA, miRNA),多态性遗传标记,遗传多态性的定义：遗传特征在个体间存在的差异。 按基因座为单位，低频等位基因的频率 0.01。 遗传多态性的分类和各自的特点； 不同遗传多态性的检测方法；,表型举例,肤色（黑色）显性 耳垂（有）显性 斜视（中国人）显性 直发（东方人）显性 趾蹼显性 眼睑下垂显性 多指显性 湿耳垢显性,检验个体遗传特征的相关技术,1. PCR 2. 杂交(hybridization） 3. 酶切(restriction endonuclease digestion) 4. 测序(sequencing) 5. 标记(labeled) 6. 电泳(electrophoresis) 7. 染色(staining)或显色(display) 8. 基因重组(DNA recombination) 9. 计算机搜索比对,生化与分子生物学基础,1生物界中心法则: DNARNAProtein 2蛋白质的特性 酶、同工酶、酶促反应（酶与底物的特异性关系） 3核酸(DNA, RNA)的基本特性： 碱基配对，可以 变性复性 Tm（变性一半的温度）= 4(G+C)+2(A+T) （melting temperature） (20bp 左右的核酸片段的Tm值计算公式) 溶液离子强度，变性剂，单链吸附现象。,4核酸5端可以被标记：标记物(放射性、非放射性)，标记要点，显示方法的差异。 5限制性核酸内切酶（识别特异性序列）、特点、意义。 6遗传变异的分子基础：突变、重组、转座子、(精子或卵子 成熟 过程)的交换重组,7基因工程技术： 杂交（要探针）， 测序技术（要引物）， 重组（加上调控序列，promoter,可构成新的遗传物质）， 8DNAchip：DNA分子的固定技术 9基因工程技术引起的伦理学问题。,DNA,蛋白质构像的改变-疯牛病（月元）,中心法则,蛋白质的特性,（毛发、精子、指甲等含胱氨酸量高，胱氨酸（-S-S-）由两个半胱氨酸脱氢（氧化）后形成, 加入b-巯基乙醇还原后变成半胱氨酸（SH），才易受蛋白酶分解。 2. 蛋白质具有两性性质，等电点（pI）偏酸的溶液中带正电，反之带负电；可以电泳分离； 3. 加热、加入乙醇、强酸强碱、重金属离子或生物碱等试剂可以使其变性；（酶的活性丧失）,4. 有4级结构，可以成为抗原，刺激产生抗体； 5. 酶（包括限制性核酸内切酶）属蛋白质，其催化功能依赖完整的酶蛋白功能域（domain）， 底物有高度专一性，要求最适温度和最适pH，有激活剂和抑制剂。 大多数酶在40以上会失活。（保存条件严格：4以下，反复冻融使活性丧失）；Taq DNA 聚合酶例外。,碱基配对,限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease）,单链多肽，最适pH为68，NaCl有抑制作用，被Mg2+ 激活，巯基有保护作用，对热不稳定，于含50甘油的缓冲液20保存； 识别序列多为回文结构，水解磷酸二酯键，切端分平头（钝端）和突出（黏性）末端两种; 回文可以倒读，举例： 池莲照晓月，幔锦拂朝风。 风朝拂锦幔，月晓照莲池。,限制性核酸内切酶举例 （DNA指纹检测和Am-RFLP时用）,切出粘端 Hpa II 5-G CGC-3 Bam H1 5 -TCCGGA-3 Eco R1 5-G AATTC-3 切出钝端（平端） Alu I 5-AG CT-3 Sma I 5-CCC GGG-3,杂交及其条件 （DNA指纹检测和HLA基因检测用),碱基配对的原则，G/C比A/T牢固（意义：退火温度要高） 变性复性的条件 单链DNA的特性吸附在硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)或尼龙膜(nylon membrane)上 杂交条件的严谨性（温度+、离子强度-、洗涤次数+）,DNA复制的条件 （细胞中/试管中比对）,单链DNA模板（解链酶、DNA拓扑异构酶） 引物的特异性20 bases（细胞中引物酶合成RNA引物） DNA聚合酶（细胞中的DNA聚合酶III）, 效率2500bp/s 原料dNTPs 合适的溶液（Mg2+） DNA复制的方向：5 3,检测基因产物多态性的局限,1基因产物易受外界因素干扰，不能持久（蛋白质结构，抗原决定族等易受破坏，改变，酶活性中心失活） 2. 技术上的先天不足 HLA的Ab与Ag各自都有广泛的交叉反应。使定型困难，或无法解释。 3. 遗传变异 ABO血型遗传变异B+OA、Cis-AB、Oh 4. 基因表达过程中影响因素多 生理病理过程基因表达受时，空（组织特异性）限制。 5人的3万多个基因中只有5%有活性。,DNA 作为个人认定的基本条件（生化基础）,1. 分别来自父亲和母亲 受精卵DNA来自于精子和卵子； 个体的生长来源于受精卵的分裂 胚胎 分化成组织器官 成熟的个体。 细胞不断分裂 ，DNA不断自我复制：严格按照半保留 法则，保证个体全部有核细胞的DNA组成与受精卵的 完全一致 。 完全个体特异的 DNA序列包含了人的全部遗传信息。世界上没有 任何两个个体（单卵双生除外）的DNA序列完全相同。,DNA标记的优点 1. 多态性高：DNA指纹(DNA fingerprint)，5000 2万个STR位点，1个SNP位点/1kb，MVR-minsatellite; 单个STR位点的等位基因数量多； 个体分辨率(discriminating power)高 2. 没有两个人(单卵双生除外)的DNA序列是完全相同的; 3. 干燥后可以长期保存（9400 y）; 4. 线粒体DNA多拷贝（几个1000个），检测灵敏度高; 5. DNA分析技术成熟，可机械化、自动化.,二. DNA分类及遗传规律,1. 父母源性: chromosomal DNA 2. 母源性：mitochondrial DNA(16569bp清楚) 3. 父源性：Y-chromosomal DNA(现已有超过150个STR位点具有多态性),DNA polymorphisms,细胞核DNA： 常染色体DNA 性染色体DNA 线粒体DNA,人 类 DNA 分 类 RBC(膜抗原及其中的酶) 基因(倾向保守) HLA 染色体DNA 编码 外显子 血清蛋白 (父母源) 调控区，内含子 同工酶 单拷贝(spacer) 卫星DNA(着丝粒周围) 串联重复 小卫星DNA(散在) 非编码 (VNTR10%) 微卫星DNA(STR) DNA 多拷贝 SINES(短) 分类 (重复序列) 散在重复 50000bp L1 线粒体DNA L2HS (母源) KpnI (父:10-4) 非编码区 D-LOOP(非重复序列),多态性(1) polymorphism,多态性概念：一个生物群体内，个体之间存在多种形态(polymorph)的现象。外在（相貌）和内在（血型, DNA等） 遗传多态性 genetic polymorphism : 遗传决定的。按基因座划分，低频等位基因 0.01。 表型(phenotype)多态性：表现型（基因产物）多态性 DNA多态性：DNA序列的个体差异，以相同基因座为单位进行比较，分为序列差异和长度差异。 注意：长度差异实质上属于序列差异。,非遗传多态性,环境因素和非遗传性因素造成的。如外伤缺指。温度影响龟、短吻鳄的性别：70 0F （ ），70 77 0F ( ），77 0F （ ）；环境影响一种海鱼的性别。 遗传性疾病不归入遗传多态性，如多指畸形，G6PD缺乏症；换血，干细胞、骨髓移植等。,基因座和等位基因的命名,1. 多态性基因座的命名(nomenclature) D8S1179 D8代表第8号染色体的DNA片段 S 表示单拷贝(single copy)片段 1179 WHO、Genbank 给出的序号 2. 等位基因的命名 按等位基因含有的重复单位（又称核心序列）数量命名 ,如D8S1179 位点, 基因型20/19, 表示一个等位基因含有20个重复单位,另一个含有19个重复单位. (core sequence, repetitive unit) 特殊现象：TH01 20.3； Penta E 19.4；,Short Tandem Repeats (STRs),the repeat region is variable between samples while the flanking regions where PCR primers bind are constant,7 repeats,8 repeats,Homozygote = both alleles are the same length Heterozygote = alleles differ and can be resolved from one another,PowerPlex 16 Ladders,(9),(9),(25),(22),(20),(10),(9),(9),(9),(10),(14),(13),(12),(8),(27),13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions,CSF1PO,D5S818,D21S11,TH01,TPOX,D13S317,D7S820,D16S539,D18S51,D8S1179,D3S1358,FGA,VWA,AMEL,AMEL,遗传标记举例,DNA多态性的分类(1),1. 片段长度多态性(染色体DNA，包括X、Y染色体DNA) 以重复序列为主:VNTR, STR 序列多态性 1) 线粒体序列多态性 2) 基因多态性: ABO血型, HLA 3) MVR序列多态性 4) 单核苷酸多态性(SNPs, single nucleotide polymorphism) (片段两翼的序列相同) 以上均指以某一位点(locus)来考虑的， 线粒体DNA控制区则以nt位置进行比对。,DNA多态性的分类(2),3. DNA指纹（DNA fingerprints） Jeffreys，AJ等1985年发现的。其图谱是由使用的核酸内切酶和探针决定的。 Jeffreys使用内切酶Hinf I、探针是肌红蛋白内含子一段重复序列（也可以用其他系列作探针）。但不是多位点（基因座）探针。 个体之间比较不能以基因座（locus）的方式进行； 其一次实验能达到的个体识别力接近辨认个体的水平。高于其他DNA分析实验。 有人将其归入“长度多态性”，实际是不对的。,“ DNA fingerprints”,重复序列的特点 The characters of the repetitive sequence,1. 广泛分布, 常在非编码区，内含子; （多属卫星DNA） 2. 两翼的序列在群体内相同，不同人种有差异; 3. 呈串连重复排列，核心序列（core sequence） VNTR(variable number of tandem repeats): minisatellite(10bp), STR(short tandem repeats)， microsatellite(26bp) 4. 个体间：重复次数不同 核心序列不同 核心序列之间插入序列不同；形成多态性 5. 遗传给子代（突变率高）,片段长度多态性(length polymorphism),特点: 1. 串联重复序列(tandem repeat); 2. 同基因座的不同等位基因，核心序列(core sequence)数量不同,因而表现为长度差异. 卫星DNA(串联重复序列),其G/C含量高,少数为A/T,沉降系数偏高或偏低. 小卫星 (minisatellite) DNA(核心序列 10-70bp) 微卫星(microsatellite)DNA(核心序列 2-6bp) 通过PCR可以检测到。,What are STRs?,Short Tandem Repeats (STR) are repetitive sequences: Tetranucleotide: AAAG AAAG AAAG AAAG Trinucleotide: CTT CTT CTT CTT CTT Dinucleotide: AG AG AG AG AG AG Tetranucleotides are favored in human identity Good balance of “ease of interpretation” and “variability found in nature”,Short Tandem Repeats (STRs),the repeat region is variable between samples while the flanking regions where PCR primers bind are constant,7 repeats,8 repeats,Homozygote = both alleles are the same length Heterozygote = alleles differ and can be resolved from one another,Different primer sets produce different PCR product sizes for the same STR allele,TCAT repeat unit,复杂重复序列举例,AGATm GAT AGATn AGACo AGATp AGACq m=3 ， n=3 ，o=3，p=11，q=8,PowerPlex 16 Ladders,(9),(9),(25),(22),(20),(10),(9),(9),(9),(10),(14),(13),(12),(8),(27),Y-STR Markers,J.M. Butler, Forensic DNA Typing, Table 8.1,DNA序列多态性,1. 线粒体序列多态性 2. 基因多态性: ABO血型, HLA 3. MVR序列多态性 4. 单核苷酸多态性(SNPs, single nucleotide polymorphism) (片段两翼的序列相同) 5. 其他 以上均指以某一位点(locus)来考虑的,mtDNA的多态性,序列多态性 D-loop区域 长度多态性 nt514-nt523：CA重复 C-stretch: polyC 9bp Delition,mtDNA序列多态性,五. DNA多态性的成因,1. 细胞分裂过程染色体DNA的交换重组 (crossover/recombination)； 细胞减数分裂前,具有同源序列的两个DNA片段 进行同源重组(homologous recombination); 3. 转座子的转座现象(transposition)（见分子遗传学与基因工 程）； 4. 基因的突变：点突变(point mutation)，缺失(deletion) /插入(insertion)，DNA重排(rearrangement), DNA复制滑动等 5. 最近（06421）美英科学家发现人类染色体有许多“跨染色 体重组”现象（染色体之间的互动），亦是可能原因。,DNA多态性的遗传与变异 1。遗传是相对的：保证物种的稳定性 2。变异(variation)是绝对的：生物进化的前提，生物 多样性(bio-variety) （DNA多态性）的成因。 3。DNA多态性在遗传过程中仍然会出现变异。STR 基因座的变异（one-step mutation, two-step /multi-step mutation）. 意义：亲权鉴定的判断须引起注意。,Steps in DNA Sample Processing,Power of Discrimination Through Multiplexing,Allele possibilities,Sample Genotype,1 in 18,1 locus: 1 in 18,Hypothetical likelihood of occurrence,结束,Commonly Used Terms,Allele: An alternative form of a gene. Allele Frequency: The proportion of a particular allele among the chromosomes carried by individuals in a population. Homozygosity: The presence of the same alleles at one or more loci on homologous chromosomes. Heterozygosity: The presence of different alleles at one or more loci on homologous chromosomes. Locus (pl. Loci): The position of a gene or chromosome segment on a chromosome. Alleles are located at identical loci on homologous chromosomes. Mixture: The presence of two or more contributors to a given sample. Multiplexing: A PCR approach that amplifies several alleles simultaneously, greatly increasing throughput. Short tandem repeats (STR): Multiple copies of an identical DNA sequence arranged in direct succession in a particular region of a chromosome.,PowerPlex 16 System Product Overview,5 bp,Advantages of Pentas vs. Tetranucleotides:,Less Stutter artifacts Highly discriminating loci Greater separation of individual alleles Fewer Microvariants,Pentanucleotides,Homozygote = both alleles are the same length Heterozygote = alleles differ and can be resolved from one another,Short Tandem Repeats (STRs),Repeat region is variable (polymorphic) Each variant is referred to as an allele Flanking region is constant KEY: Alleles are distinguished by length,Current Forensic STR Multiplexes PowerPlex 16 and PowerPlex 16 BIO,100 bp,500 bp,200 bp,300 bp,400 bp,600 bp,TH01,D3,D21,D18,Penta E,D5,D13,D7,D16,CSF,Penta D,A,vWA,D8,TPOX,FGA,100,500,200,300,400,600,Allele Calls,Human Identity Testing Applications,Forensic cases: matching suspect with evidence Paternity testing: identifying father Convicted felon DNA databases Missing persons investigations Mass disasters - putting pieces back together Historical investigations Immigration Military DNA “dog tag”,DNA Use in Forensic Cases,Most are rape cases (2 out of 3) Looking for matches between evidence, victim, and suspect Must compare DNA profiles,Mixtures must be resolved if present DNA is often degraded Inhibitors to PCR and sample contamination are often present,Challenges,Overview of PowerPlex 16 System,Single Amplification Systems 13 CODIS loci, 2 penta loci, Amelogenin PowerPlex 16 validated for SpectruMedix platforms PowerPlex 16 fully validated for CODIS/NDIS casework and database applications PowerPlex 16 Released May 2000 Matching Probability of 1:1x1017 - 1:1x1018,Human Identity Market Summary,Made up of local, state, and federal law enforcement agencies as well as private reference and paternity labs Often resistant to change due to validation requirements and shortage of time and resources for retraining Greatest influence comes from use and validation by other agencies, esp. within their state or FBI stamp of approval May require significant up-front handholding until validated Hungry for alternative to AB reagents and instrumentation,MVR核心序列片段长度相同,个别碱基不同,Type1: CAC AAT ATA CAT GAT GTA TAT TATA Type1a: CAC AAC ATA CAT GAT GTA TAT TATA Type2: CAC AAT ATA CAT GAT GTA TAA TATA Type3: CAC AAT ATA CAT CAT GTA TAT TATA Type3a: CAC AAT ATA CAT CAT GTA TAA TATA Type4: CAT AAT ATA CAT CAT GTA TAT TATA Type4a: CAT AAC ATA CAT CAT GTA TAT TATA Type5: CAT