动物细胞培养和核移植技术 课件（人教版选修三）

动物细胞工程,原平一中肖文来,专题2 细胞工程,学习目标： 【知识能力】 1、动物细胞培养的过程、条件及应用 2、应用细胞的基础知识，分析细胞工程的理论基础 【情感态度与价值观】 1、讨论细胞工程技术的社会意义 2、认同细胞学基础理论研究与技术开发之间的关系,动物细胞工程常用的技术手段：,动物细胞培养、 动物细胞核移植、 动物细胞融合、 单克隆抗体,思考：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养、 植物体细胞杂交,强调：,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,动物细胞培养和核移植技术,一、动物细胞培养,1.发展历史: 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,2、动物细胞培养的应用和概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,一、动物细胞培养,动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,1、概念：,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,阅读思考：,为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？ 怎样分散？,用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要 成分是什么？用胃蛋白酶行吗？,3 什么是细胞贴壁和细胞接触抑制？,什么是原代培养和传代培养？传代培养的细胞 具有 什么特点？,为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？怎样分散？,1.成块的组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增值。 2.从健康动物体内取出组织块，剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理,用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分 是什么？用胃蛋白酶行吗？,1.在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。 2.动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,动物细胞生长特性：,细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,什么是原代培养和传代培养？ 传代培养的细胞具有什么特点？,原代培养：将动物组织用胰蛋白酶处理成单个细胞，配制成一定浓度的悬浮液，放入培养瓶中在培养箱中培养的过程 传代培养：培养瓶中的细胞越来越多，用胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成悬浮液，分瓶培养的过程,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,遗传物质未改变,有关概念,从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,：,传代培养：,原代培养,原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。 细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,有关概念,细胞株：,细胞系：,细胞株和细胞系的区别：,探究：,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养细胞应该模拟内环境的哪些内容呢？,探究,1、植物组织培养过程要将组织分散成单个细胞吗？,、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞吗？,、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？,、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？,没有,是,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖,先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶处理,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成份是蛋白质,、细胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,探究,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。,这样的过程叫做传代培养,探究,14、如何理解原代培养和传代培养？,15、传代培养的细胞都能一直传代下去吗？,16、有些为何能一直传下去吗？,17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？,18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？,上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养,不都能,发生突变，朝着癌细胞方向发展,不是,保存10代以内的细胞，因为1050代部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分遗传物质发生改变，发生突变向癌细胞方向发展。,探究,小结,一、动物细胞培养 1、概念 2、过程 3、条件 4、应用,动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,1、概念：,动物细胞培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,细胞株,细胞系,细胞增殖能力强,无限传代,去掉组织间蛋白,动物细胞培养不能 最终培养成生物体,1、无菌、无毒,2、全部的营养物质,3、适宜的温度和PH值,4、必要的气体条件,（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）,（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）,保证细胞顺利的生长增殖,36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4,O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,3、条件：,维持培养液的PH,动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,（1）液体培养基,（2）含有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,4、应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植株,培养结果,获得细胞或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,器官上的细胞生命力因为这些组织或旺盛，分裂能力强,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,1、在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（ ） A细胞一直在细胞悬液中分裂生长 B有少部分细胞可能在培养条件下无限地传代下去 C有部分细胞核型会发生变化 D. 个别细胞会发生基因突变,2、下列过程与细胞培养无关的是-（ ） A.检测有毒物质 B.生产单克隆抗体 C.筛选抗癌药物 D.杂交育种,A,D,练习：,我们能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？,根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达；把两种动物的优良性状集合在一块儿?,思考：,二 、动物体细胞核移植技术 和克隆动物,2.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）,分 类,细胞分化程度低，恢复全能性容易,细胞分化程度高，恢复全能性不容易,2.1 动物细胞核移植概念：,（难度高）,用核移植的方法得到的动物称为克隆动物,2.2体细胞核移植的过程：,请看教材P48图2-21,思考： 1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？ 2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。,过程,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵母细胞（减中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,电刺激,重组细胞,重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,新个体(与母体相同的个体),核移植,讨论：,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,2.3体细胞核移植技术的应用前景：,1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程,2、保护濒危物种,3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植,4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,成功率低 存在健康问题 克隆动物食品的安全问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体 型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷， 免疫失调等。,3.体细胞核移植技术存在的问题,1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？,提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。,思考与探究,2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,体细胞核移植技术为什么要选择MII期的卵母细胞做受体细胞？,细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有MII期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用MII期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于MII期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细胞减数分裂的MI期和MII期达到最高，受精或激活后，MPF迅速灭活，因此，MII期卵母细胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。MII期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而MI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MI期卵母细胞MPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。 也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。,小结：,动物细胞工程,核移植技术,1.克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,多莉与“母亲”,细胞核移植,多莉羊的培育过程,克隆动物的研究意义,1.用于生物学和医学研究的实验动物 2.改良动物品种 3.治疗人类疾病 4保护濒危动物,6.世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：,写出 、所指的细胞工程各称： 。 实施细胞工程时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是： 。 多莉面部的毛色是 ，判断依据： 。 继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有 。 请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义： 。,中国自主完成的首批成年体细胞克隆牛在山东曹县陆续降生。克隆牛有3个母亲,A牛提供细胞核即供体细胞,B牛提供去除细胞核的卵细胞即受体细胞,两种细胞在电脉冲的刺激下融合之后,通过细胞分裂形成早期胚胎,再将这个胚胎植入C牛子宫内。请回答下列问题: (1)培育出的克隆牛几乎就是 牛复制品,这是因为控制牛性状遗传的物质主要存在于_中。 (2)克隆牛的培育成功说明了_。,A(供核牛),细胞核,体细胞的细胞核几乎具有发育为新个体的全部遗传信息,练习,动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,（二）动物细胞融合,1.过程：,细胞融合,物理法,化学法,生物法：,灭活的病毒,仙台病毒,丧失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,（诱导细胞融合）,（二）动物细胞融合,1.过程：,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞,细胞融合与诱导细胞融合物质,诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇 诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。 思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？,动 物 细 胞 融 合,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用 途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱,导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,原 理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物、动物细胞融合的比较,二、单克隆抗体,什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞产生抗体。,B淋巴细胞与抗体,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,(三）单克隆抗体,抗体,1。抗原 动物体内,抗原不纯,抗体不纯,2。特异性差、纯度低；,产量低、反应不够灵敏,(三）单克隆抗体,设计方案： 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,-化学性质单一、特异性强的抗体。,杂种细胞,？,？,诱导其融合的方法有哪些？,抗原,效应 B细胞,(三）单克隆抗体,2.制备过程：,？,？,抗原,效应 B细胞,筛选,筛选,杂交瘤细胞,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,二、单克隆抗体制备过程,诱导其融合的方法有哪些？,融合后培养液中有几种细胞,怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点,注射抗原的目的是什么,为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选,大量增殖杂交瘤细胞获得单克隆抗体的方法,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,3.单克隆抗体的应用：,在基础理论研究中具有重要意义,在疾病诊断、治疗和预防方面，具有 特异性高、灵敏度高等优越性。,生物导弹,(三）单克隆抗体,小结,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无