BET系列说明书(全).doc

细菌内毒素测定仪系列使用说明天津大学无线电厂细菌内毒素测定仪使用说明书目 录第一章 细菌内毒素测定仪应用的鲎试验原理2第一节 定量分析方法2一、动态分析方法2二、终点分析方法2第二节 反应时间的确定21、OD限值法32、透光率限值法33、T50归一化法4第三节 测定原理4反应时间法标准曲线的测定未知内毒素原理4反应速率法标准曲线的测定未知内毒素原理5第二章 试验前期工作7试验器材准备7试验所需试剂7试验用具的处理：7实验器具在实验中的作用8第三章 动态浊度法试验中常见问题9供试品细菌内毒素限值的计算9供试品最大有效稀释倍数的计算9标准曲线的构造10阴性对照10供试品溶液中干扰物质的处理方法10供试品回收试验及内毒素检测11基本概念11回收实验管的制备12不干扰稀释倍数的选择12样品中葡聚糖的鉴别12检测结果数据处理分析13内毒素标准曲线的宽窄问题：14鲎试验过程中注意事项：14第四章 细菌内毒素测定仪的使用16一仪器概述16仪器适用范围16适应三类鲎试剂：16三种定量分析方法：16性能参数17软件运行环境：18软件特点:18二软件安装指南18三软件与仪器通讯19四软件使用详述20（一）主界面201文件管理栏2111 检品管理中心2112 当前打开检品文件212 菜单栏2221 退出2222 参数设定2223 数据合并2224 网站链接2325 新实验23251 标准曲线设置23252 样品设置24253 阴性阳性对照设置26254 试管位置设置26255 向导使用说明26（二）子界面26实验数据表格28观察反应曲线281 实验数据记录29实验数据表格30实验分析方法：312. 观察反应曲线323 结果打印预览35五软件使用常见问题37EasyBET2.0件升级后如何保存原文件37如何进行实验数据的添加与删除37如何进行温度设定与校准37如何识别试管插入后检测与否37检测报告中实测内毒素数值打“？”为何意38检测报告中“检测限！”的标识为何意38实验中空白表格填写注意事项38第五章 实验操作指南39实验设置向导39内毒素标准曲线制作试验40稀释法示例1：湛江海洋鲎试剂41稀释法示例2：湛江海洋鲎试剂43稀释法示例3：厦门鲎试剂厂鲎试剂46稀释法示例4：福州新北鲎试剂48稀释法示例5：显色鲎试剂51附1 细菌内毒素实验动态浊度法标准曲线的准确度54标准曲线的误差55标准曲线的高次曲线拟合57附2 2000年药典细菌内毒素定量测定法58附3 细菌内毒素实验配套器材及消耗材料60附4实验操作流程和注意事项60附5易泰实验室介绍61前 言60尊敬的用户，感谢您选用本仪器，同时祝贺您获得了细菌内毒素定量检测的有力武器。您可以将它应用于注射药品、输液器具、生产工艺控制、临床检测体液等方面。 1964年 Jack Levin和 Frederik BBang等人发现细菌内毒素可以迅速引起鲎血细胞溶解物(鲎试剂)发生凝集反应，从而导致产生了目前最灵敏的细菌内毒素检查方法。这种方法经不断完善，应用越来越广泛。自从美国药典20版(1980年)收载了“细菌内毒素检查法”以来，美国药典收载的药品中，原规定的热原检查项逐渐被细菌内毒素检查项所取代，一些原来未规定热原检查项的品种也增设了细菌内毒素检查项。美国药典24版(2000年)收载的药品中，有586种规定了细菌内毒素检查项。中国药典(2000年版)也正式收载了“细菌内毒素检查法”，并对鲎试剂、内毒素标准、试验程序、判断标准作了规定，在这种条件下，应用细菌内毒素测定仪来进行内毒素的定量检测，对提高检测水平和制药单位提高全面质量控制，具有十分重要的意义。 经过多年的努力，在1993年，由开封155医院、中国药品生物制品检定所、天津大学无线电厂联合研制成功BET-32型细菌内毒素测定仪，开始了我国应用国产仪器进行细菌内毒素定量检测的先例，在仪器推出的几年内，得到了用户的大力支持，纷纷将仪器应用于生产过程的质量控制，并取得了较好的效果，提高了检测水平，同时也对我们深入开发新一代仪器，提供了很大的帮助。由于不能一一尽列，在这里我要对所有对我们的仪器提出建议及批评，所有帮助过我们的老师和朋友们一并表示感谢。为了更快的推进我国细菌内毒素的发展，更方便用户使用，2001年我们推出性能指标可与国外同类产品相媲美BET72型细菌内毒素测定仪。相信凭着我们良好的信誉，优良的品质，快捷的服务，一定会使您在工作中得心应手。“提供最简便的试验方法，最可靠的实验仪器，最齐全的试验材料，最新的相关信息。”是我们易泰实验室的宗旨；“Always try it for best”是我们的信念, 希望我们的工作给您予帮助。我们真诚希望广大的用户在使用过程中发挥聪明才智，更好地利用仪器和试剂，提高检测水平和扩大检测品种，总结检测技术；也希望您与我们联系，给我们多提供宝贵资料，多多支持，共同推动我国的内毒素事业的发展，使我国鲎试剂的应用水平达到国际先进行列。 为更好地发挥本仪器的性能，请详细阅读使用说明书，和有关其它文献，如果您在实验中遇到问题，请及时与我们联系，以便为您提供及时的技术支持。 愿您在使用BET系列细菌内毒素测定仪的过程中得心应手。 技术支持：易泰实验室地址：天津大学无线电厂 开发部邮编：300072电话真址：/EasyBET/index.htm第一章 细菌内毒素测定仪应用的鲎试验原理鲎试剂发明以来，人们根据它与细菌内毒素的反应特性开发了多种实验方法，只有凝胶法成为一种公认的法定方法被全世界承认，基于凝胶特性的动态浊度法也被各国药典收载，鲎试剂凝胶过程同时伴随着浊度变化，利用浊度变化的动力学特性建立动态浊度法。第一节 定量分析方法根据鲎试剂与细菌内毒素反应快慢与内毒素含量相关的特点，无论是浊度法鲎试剂还是动态比色法鲎试剂都能检测鲎试验反应的透光实时变化曲线，可以建立曲线分析方法，其中根据动力学反应曲线的特征建立以下分析方法：一、动态分析方法1、预设限值法：当反应曲线的OD值上升到预设的限值的时间，或透光率下降到预设限值的时间作为临界时间，根据临界时间的对数与内毒素含量的对数成反比的规律来定量。(该方法为我仪器默认方法，预设OD值为0.02)2、曲线拐点T50法：检测到反应曲线的拐点，即反应速率最大点的时间作为临界时间，根据临界时间的对数与内毒素含量的对数成反比的规律来定量。3、反应速率法：检测到反应曲线的最大反应速率，即曲线的最大斜率，该斜率的大小与内毒素含量的对数成正比。二、终点分析方法1、终点浊度法：利用当反应曲线达到设定时间时的吸光度值与内毒素含量的对数拟合标准曲线，由于凝胶以后浊度不再上升，所以所有参加计算的点必须在产生凝胶以前，否则将产生很大误差。2、终点比色法：利用终点比色试剂根据内毒素多少释放对硝基苯胺PNA，检测黄色的PNA含量或用偶氮化试剂将其变成颜色更深的粉红色，用光度计读吸光度，根据该吸光度与内毒素含量的对数成正比的规律来定量。第二节 反应时间的确定反应时间是动态浊度法进行定量测定的重要参数，反应时间标志着鲎试剂反应的快慢和样品中细菌内毒素的含量多少，目前在国际上开发的反应时间判定方法有以下三种：OD限值法、透光率限值法、T50归一化法，1、OD限值法测定反应曲线为吸光度变化曲线，预设一个吸光度OD值，当反应曲线从开始上升到该预设值时经历的时间作为反应时间，该方法的优点是时刻变化的OD值是与反应产物的数量成正比的，也就是吸光度变化曲线与凝胶产物的产生关系为线性，我们也采用与国际上其他仪器相同的取值，取当OD上升0.02作为预设点，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间。T3T2T1OD预设OD值时间T4 图1-1 吸光度限值法反应时间确定2、透光率限值法使用透光率描述鲎试剂的浊度变化，吸光度实际就是透光率的负对数值，日本的ET-201型仪器采用透光率下降到95%的点作为反应时间临界点，将95%取负对数正好是0.02，所以该法与OD限值法选取的凝胶临界点是相同的，但该法所描绘的透光率反应曲线与反应产物的量是非线性关系。T3T2T1T4透光率预设透光率时间 图1-2 透光率下降法反应时间确定3、T50归一化法细菌内毒素与鲎试剂的动力学反应其吸光度的变化曲线符合动力学方程。曲线的拐点即反应速度最快点，将拐点的时刻作为反应时间，是该反应曲线最富于特征的点，为寻找拐点特发明了归一化方法、在检测过程中由于试剂中杂质、气泡、以及电磁干扰等问题的存在，检测到的反应曲线有时发生扭曲，如果直接计算拐点和斜率经常发生较大误差，由于拐点是该曲线的中心对称点,与浊度达到50%的点极为接近,用该点代替拐点有很高的稳定度。T3T2T1归一化浊度50%的中点时间T4 图1-3 T50归一化法反应时间确定在本仪器开发的初期，由于各试剂厂家的质量和反应特性有很大不同，试管的直径壁厚都有所不同，导致检测到的初始透光强度，和透光强度变化很不一致，将所有的反应曲线归一化后，即反应初始认为浊度为零，反应结束时认为浊度为1，经过归一化的曲线很容易计算拐点，但该方法需要将完整的反应曲线检测出来，才能准确判断处理，否则容易误判，造成假阳性，需要的检测时间比较长，鲎试剂的灵敏度也要求比较高。第三节 测定原理反应时间法标准曲线的测定未知内毒素原理理论分析和大量试验表明，无论以哪种方法确定的反应时间，它都是内毒素含量的标志，内毒素浓度和成胶时间为负相关，即内毒素浓度越高成胶时间就越短。实验证实，临界时间与内毒素浓度C之间也是负相关，其经验公式如下【11】： (1.3-1)对上式两边取对数可得： (1.3-2)通过对标准品进行实验，可得C-关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对实验品进行检测时，根据试验品的临界反应时间和式(1.3-2)，即可求出其内毒素浓度值【1】。检测样品反应时间通过标准曲线反算浓度度lgTlgClgClgTTxCx系列稀释标准品与反应时间回归标准曲线归标准曲线图1-4反应时间法定量测定原理反应速率法标准曲线的测定未知内毒素原理大量试验表明，内毒素浓度越高成胶时间就越快，即反应速度快，将动力学反应曲线变换成微分曲线，即反应速率曲线，OD/min时间Vm3Vm2Vm1OD时间其反应速率最大的点即是反应曲线的拐点，该点的时间作为反应时间就是反应时间法中的T50法，最大的反应速率也与内毒素含量相关，经实验证明，最大反应速率Vmax与内毒素浓度的对数成正比，内毒素浓度越大最大反应速率越大，其经验公式如下： Vmax = a0+ b0LgC通过对标准品进行实验，可得C-Vmax关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对试验品进行检测时，根据试验品的最大的反应速率Vmax代入标准曲线方程，即可求出其内毒素浓度值。 样品的最大反应速率通过标准曲线反算浓度VmaxlgClgCVmaxVxCx稀释的标准品与最大的反应速率回归标准曲线图1-6反应速率法定量测定原理第二章 试验前期工作试验器材准备所需仪器 细菌内毒素测定仪 烤箱 漩涡混合器（振荡器） 超声清洗机低速离心机 (血前处理)玻璃器材 稀释用大试管 加样头 仪器专用反应管其它用具微量移液枪冰浴槽 试管架 封口膜硫酸洗液 三效热原灭活剂试验所需试剂1 细菌内毒素标准品为了取得相同数据，试验中所用细菌内毒素标准物质应使用由中国药品生物制品检定所研制、标定和分发的可用于定量测定的细菌内毒素国家标准品和工作标准品。2 鲎试剂本仪器适用国内各鲎试剂厂家生产的定量鲎试剂，也可用不低于0.06EU/ml的高灵敏度鲎试剂，另外，满足以下要求的鲎试剂将能够获得非常理想的检测效果：溶解后澄清度高、最大浊度变化大，最小不能小于0.1OD值，灵敏度高（最好在3600秒内检测到0.01EU/ml的内毒素，但速度过快也不好，操作的速度将影响结果，比如0.5EU/ml的内毒素反应时间应在1000秒左右比较好）。3 细菌内毒素检查用水用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，含内毒素的量应小于0.005EU/ml。反应时间最好要大于7200秒。 试验用具的处理：实验中用到的试管，加样头等玻璃用具要提前进行除热原处理，除热原的处理方法有多种，最常用的方法为烘烤。方法1：用硫酸洗液浸泡6-12小时后，用清水洗净，再用蒸馏水冲洗，最后放入烤箱，在250的温度下烘烤2小时，即可除掉热原。（常用）方法2：用三效热原灭活剂配制的溶液放在超声波洗涤机里对玻璃用具进行开机清洗10分钟，然后先用清水清洗数遍，再用蒸馏水冲洗数遍，最后放入烤箱，在250的温度下烘烤2小时。（推荐）另外还有用双氧水浸泡等方法，但耗时较长。注：“三效热原灭活剂”由国家卫生部“十年百项成果推广计划”首批推广的十项重大医药卫生新技术“临床输液热原反应原因及预防方法”课题组研制。我实验室用方法2处理玻璃用具，实验表明此方法比常用的方法1省时、安全，效果理想，特此推荐。（如购买见附录实验耗材）实验器具在实验中的作用a.试管：盛装鲎试剂和样品的反应容器b.大试管：稀释细菌内毒素时使用c.加样头：配合微量移液管，往试管中加入鲎试剂或样品d.微量移液管：加样e.旋涡混旋器：将细菌内毒素的水溶液混旋均匀f.封口膜：将试管口封闭，防止反应物中的水分蒸发和灰尘落入g.试管架：溶解和加样时放置试管h.冰浴槽：当实验环境温度过高，在槽中放入冰水混合物，将试管架放入其中，建立冷环境，使试管在插入BET系列的反应器之前不发生反应。 第三章 动态浊度法试验中常见问题供试品细菌内毒素限值的计算 供试品内毒素限值按以下公式确定： LK/M 式中 L为供试品内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，以EU/kgh表示，注射剂K5EU/(kgh)放射性药品注射剂K2.5EU/(kgh)鞘内注射剂K=0.2 EU/(kgh)M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)、U/(kgh)表示，中国人均体重按60kg计算, 注射时间小于1小时，按1小时计算。 按人用计量计算L值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际作必要调整。供试品最大有效稀释倍数的计算含标准内毒素的供试品溶液的制备 首先按下式计算供试品溶液的最大有效稀释倍数（MVD）和干扰试验中供试品的稀释倍数(D)。 MVD=LC/1 D=LC/m式中 L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度,其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml。说明：1）浓度c的计算，例如：当限值L=0.5EU/ml时，C=1.0ml/ml，可直接计算； 当限值L=5EU/1000单位，每瓶装量为X单位时，那么可以加Yml水溶解，此时C=X/Y mg/ml，再计算最大稀释倍数，MVD=LC/1； 当限值L=0.2EU/mg时，可以取部分称重，称Xmg加Yml水，此时C=X/Y mg/ml再计算最大稀释倍数， MVD=LC/1。 2）干扰实验中供试品的稀释倍数D 公式D=LC/m中为所做标准曲线中间点的浓度，此公式的意义在于，供试品D倍稀释后所测内毒素值会落在标准曲线的中间，减少其所测值的误差。但通常第一次预实验后，我们得到的理想不干扰倍数下所测内毒素值不在标准曲线中间，那么我们可以通过公式m= LC/D求出m，再根据此中间点来重新设计标准曲线，使其所测值更加理想。例如：某供试品L=1EU/ml，标准曲线所做点为1，0.5，0.25，0.125四个标准浓度点，通常对倍稀释4个点时m取值为41=0.5EU/ml，MVD=L/1=8，在做4，8倍的干扰实验时发现稀释8倍后样品所测值较为理想，此时D=8，则m= L/D=0.125，再做实验时可以按此m值把标准曲线四个浓度点调整为0.25，0.125，0.06，0.03，使8倍稀释后的样品所测值落在标准曲线中间。 如果样品所测内毒素值较低，调整后的最低标准浓度点过低，影响到标准曲线的检测，则不需调整。一般情况下，只需检测值不超出标准曲线范围即可，因为该操作的误差影响在整个实验中的所占比重不大。标准曲线的构造在进行标准系列的制备时，2至10倍的稀释方法都可以使用，不过，其中对倍稀释和10倍稀释较为方便也比较常用。10倍稀释所得的标准曲线的检测范围宽，所以，当我们不知道所要检测的样品内毒素含量的确切范围或者是要同时检测几种限值相差很大的样品的时候，那么使用10倍稀释有标准曲线就比较方便，可以做到一步到位。将细菌内毒素标准品用细菌内毒素检查用水按等比例稀释（如对倍稀释，10倍稀释等，制备成一个至少包含四个标准浓度的标准系列溶液，例如0.5, 0.25,0.125, 0.06, 0.03Eu/ml系列或10，1，0.1，0.01Eu/ml系列），且每个数量中至少要有一个标准浓度。 每个标准浓度在检测时最少要做两个平行管。在定量测定中，不是指鲎试剂的标示灵敏度，而是表示标准曲线中最低的标准浓度，即该曲线的最低检测限值。例如10，1，0.1，0.01Eu/ml标准系列中，0.01Eu/ml 即为。 阴性对照 阴性对照的目的一是为了测定用于稀释标准品系列和样品水中的内毒素含量，确保其不会影响试验的可靠性；二是为了检测鲎试剂的质量。 阴性对照中的内毒素含量必须明显低于最低检测限值，否则试验无效。供试品溶液中干扰物质的处理方法作为供试品溶液中的干扰物质一般采用稀释法即可排除，对于用稀释法不能解决的样品，可采用其它方法给予排除，如加热法、PH调节法、溶液过滤等方法。然而对于大多数样品来说，将样品进行更大倍数稀释一般是可以排除干扰物质的影响。常用的处理方法有以下几种。1稀释法 有些样品的干扰因子在一定浓度下才起作用，把样品适量稀释后即可按常规方法测定。如高浓度的葡萄糖注射液等。2加热法有些干扰因子为不耐热的物质，将样品在适当温度下保持一端时间，即可按常规方法测定。如某些血液制品和生物制品等。3调整PH值有些样品PH值偏高或偏低，且鲎试剂中PH缓冲剂不能将反应液调整至正常范围。这就可用预先处理并已确认无菌无热原的盐酸或氢氧化钠液调整样品液PH。然后按常规方法测定。4超滤反冲法一般中草药注射液成分复杂，干扰因素较多，难以用普通方法加以消除。即可用超滤法。按制备无热原样品液法，取样品液适量，进行超滤，样品药液全部压滤通过超滤膜，内毒素被阻滤在超滤膜片上，在取少量无热原水冲洗滤器，滤膜。卸开滤器，将滤膜反向放置滤器上，严密固定。再用无热原水将内毒素从超滤膜上冲至一量瓶中，精密加水至刻度。冲洗液按常规法测定。对于复杂样品还需将上述四法联合应用。但不管单独用其任何方法时，在操作过程中均有可能出现系统误差，使测定浓度高于或低于实际浓度，这里必须做回收实验。供试品回收试验及内毒素检测 基本概念（1）干扰预试验是在不知样品具体不干扰稀释倍数情况下，对样品进行不同倍数的稀释，做其各个稀释倍数下的样品阳性管及样品管。我们在不知供试品具体不干扰倍数情况下，需要做此实验来确定其稀释倍数。根据样品具体的情况进行不同稀释倍数的选择，操作者可以灵活掌握。（2）干扰实验即为回收实验，供试品回收试验是在供试品或供试品的稀释液中加入某一已知浓度标准内毒素，再与鲎试剂进行反应，然后用此溶液的内毒素检测值减去供试品或其稀释液本身的内毒素检测值，即得到内毒素回收值。将回收值除以加入的标准内毒素值，再乘以100，就得到内毒素的回收率。当回收率在50200之间时，则表示该供试品在此浓度下对鲎试剂反应不干扰，可进行内毒素检测，否则就需进行更大倍数的稀释或采用其它的方法来排除干扰。（3）2000年药典中的相关规定供试品溶液和添加内毒素标准溶液的供试品的内毒素含量Et和Es，按下式计算该试验条件下的回收率（R）。R=(Es - Et)/ m 100%内毒素的回收率在50%200% 之间时，则供试品在该试验条件下不存在干扰因素；当内毒素回收率超出该范围时，须采用适宜的方法消除干扰因素，而且这种消除的有效性必须用上述干扰试验加以证实。如未稀释或稀释倍数小于MVD的供试品溶液呈现干扰作用时，应增加稀释倍数后重新进行试验，但稀释倍数不得超过MVD。回收实验管的制备回收试验中加入的内毒素要与标准曲线中的一个标准浓度相同，一般最好选择在标准曲线的中心或中心附近的值。如50，5，0.5，0.05，0.005EU/ml标准系列中，0.5EU/ml就是比较合适的加入值。而对于由4,5或6个点组成的两倍稀释有标准曲线来说，选用41的标准浓度也是比较常用的一种方法。例如在0.25,0.125,0.06,0.03Eu/ml标准系列中，0.125Eu/ml即为41标准浓度。 制备回收试验管的方法一般为，用稀释倍数相当于0.5倍所需倍数下的供试品液加上等体积的2倍所需浓度的标准内毒素，混匀即可。举例说明：如要制备含标准内毒素0.25Eu/ml的80倍供试品稀释液，则可用1ml 40倍供试品稀释液加上1ml浓度为0.5Eu/ml的标准内毒素即可得到2ml所需的含标准内毒素0.25Eu/ml的80倍回收试验液。 不干扰稀释倍数的选择如果在所做干扰预实验结果中，如果有多个回收率符合要求，在50%200%之间，可以遵循以下原则进行选择：1）一般情况下，选择回收率最接近100%的稀释倍数是比较理想的，但是其前提条件是样品在该稀释倍数下，在相应反应时间内可以检测出具体内毒素值，这个反应时间应该小于所做标准曲线最小浓度点的反应时间，因为这样所测值才在标准曲线范围内。2）如果在回收率接近100%时，由于样品在该稀释倍数下内毒素含量过低，在相应的反应时间内测不出该值，那我们可以选择符合回收率范围的第二最小稀释倍数。例如，某样品在预实验中稀释20、40、80倍的回收率分别为180%、150%、90%，但在回收率为90%的情况下，该稀释倍数下样品含量过低，其反应时间过长超过准曲线最小浓度点的反应时间，那我们选择回收率为150%的稀释倍数为理想不干扰稀释倍数。3）如需对药品内毒素严格控制回收率范围可选在75%125%之间；样品中葡聚糖的鉴别1(1-3)-D-glucan概念：(1-3)-D-glucan在自然界的分布很广，主要存在于担子菌、真菌、地衣类、高等植物以及酵母、藻类的菌体成分中，平均分子量在6800左右。分子结构具用多样性。另外，某些使用人造纤维制作的人工肾透析模上也含有类似物质。2(1-3)-D-glucan的检测它可以与鲎试剂中G因子系反应，同内毒素与鲎试剂中C因子系反应一样，其中被激活的凝固酶切断凝固蛋白原中特定位置的精氨肽链，形成凝固蛋白产生凝胶的浊度变化，造成假阳性结果。那么怎么区分这种现象呢？现在可以在本软件通过反应速率法分析出来，而且反应曲线也与正常曲线不同。（1）从下表中用两种方法反应时间法和反应速率法所测得样品内毒素含量对比中，可以看出对于标准曲线用两种方法所测值接近，在误差范围内；而含有葡聚糖的样品两种方法所测值差别很大，由此可以发现所测样品中含有葡聚糖，尤其是当作干扰实验过程中，无法用稀释的办法排除干扰，回收率始终很大时，要考虑到是否有葡聚糖干扰实验。反应样品外加内毒素EU/ml反应时间法实测内毒素含量EU/ml反应速率法实测内毒素含量EU/ml标准曲线109.69569.0745标准曲线10.86791.3106标准曲线0.10.12070.0851标准曲线0.010.0090.0106含葡聚糖的样品0.23810.0165（2）从反应曲线也可以明显区分出来。含有葡聚糖样品的曲线反应启动较早，但是反应速率比较小，曲线看起来很平直，明显区别于其它内毒素标准品的曲线，反应曲线见下。检测结果数据处理分析标准曲线有效性评价有效的标准曲线的要求是： a.最少有四个连续浓度梯度点。 b.每个点至少2个平行管，平行管的变异系数不应大于10%。 c.生成的标准曲线的相关系数| r| 0.98。 d.标准曲线的斜率和截距不应过大或过小。结果判定时注意点：a：阴性对照管：检测出的Tg或OD值必须在标准曲线最低细菌内毒素浓度C值以下，即在内毒素标准曲线的延长线外求得，否则实验无效重新进行试验。即实验过程中的阴性对照是必不可少的。根据经验，阴性对照管的反应时间在6000秒以上为好。b：检测数据按最小二乘法回归处理，其细菌内毒素标准曲线的相关系数r的绝对值必须在0.980以上，表明标准曲线的可靠性成立。c：供试品中的细菌内毒素含量计算，必须在标准曲线以内的检测数值才是有效的。在标准曲线以外的数值根据情况一般不参与计算。但对于内毒素含量很低的样品溶液除外。d：为确保样品溶液与LAL（TAL）试剂反应无干扰因素的影响，添加内毒素样品溶液样品阳性对照管测得的回收率必须在50200%以内。对于企业内部质控应该控制在75125%之内。内毒素标准曲线的宽窄问题：内毒素标准曲线的宽窄：即细菌内毒素标准曲线测定范围，细菌内毒素标准品在稀释时，一般都采用2-10倍的等比稀释方法,最大稀释倍数不得超过10倍。试验过程中，到底是2、4还是采用10倍稀释，主要取决于所用定量检测系统对所使用LAL（TAL）试剂的适用性能、最低内毒素检测浓度和样品溶液中内毒素污染量，同时更取决于操作人员的习惯。10倍稀释检测范围宽，适用于临床、药检所、药厂检品多，多样化的特点，而且多次标准曲线重现性好；在2、4倍稀释过程中，因为稀释倍数的减少，实验器材计量不准引起的误差所占比重越来越大，所以结果也就相对不如人意。实验过程中，究竟采用几倍稀释，要根据具体情况，选用适宜的稀释倍数，尽量使检测值更接近于真值。 鲎试验过程中注意事项： 1 内毒素工作品 细菌内毒素是一种脂多糖大分子，很容易吸附到实验器具壁上，其水溶液放置一端时间后其活性就会降低，在旋涡混合器上充分震荡，其活性就会恢复。所以在实验中内毒素工作品溶解后要充分震荡15分钟，每稀释一步和加样前都要再次震荡30秒。标准曲线的稀释操作时间也不要过长，控制在半小时以内为好。内毒素水溶液放置在冰浴槽的冷环境中会使其效价的下降变慢。2 鲎试剂 鲎试剂的水溶液应该透明，不能有溶解不了的悬浮物，否则会对反应检测产生干扰。鲎试剂溶解以后，要静置几分钟再分装。如果一次实验所做管数太多，所需鲎试剂全溶解分装后，从第一管加样插到反应孔内到最后一管做完所需时间过长，后面的鲎试剂很容易受到污染。所以可以把该实验分几次完成，如先做标准曲线，后做样品，鲎试剂分几次溶解。当室温过高时应使用冰浴槽，将溶解的鲎试剂降温。如果实验检测不到任何曲线，而反应结束后取出试管，发现试管底部液体已经凝胶而上部仍旧为澄清液体的情况，就是环境温度过高，或鲎试剂被污染的结果。3 细菌内毒素检测用水为了避免实验受到污染，可能造成不好结果，要特别注意下列检测用水，建议：溶解内毒素标准品的水不可再用；溶解鲎试剂的水要重新开启；做阴性对照的水要重新开启。4 操作环境温度 鲎实验反应温度为37，如果室内温度过高，会提前反应。可用仪器配置的冰浴槽放入冰水混合物，把试管架放入其中进行稀释品操作。5 取样方法加样反复吸放数次，令内毒素溶液更加均匀。6当向仪器插入反应管时一定不要碰到其它反应管，以免光路发生变化，造成检测不准。第四章 细菌内毒素测定仪的使用一仪器概述80年代，我国研制出稳定的鲎试剂，鲎试剂的应用突飞猛进，原开封155医院的胡冠时主任开始摸索定量测定的方法，并设计了XNC-1型，肉眼观察、手工计算的定量测定仪，成为日后仪器发展的实验基础和理论依据。 从89年开始，由开封155医院、中检所、天津大学无线电厂合作研究开发我国的动态浊度仪。 93年，BET-32型细菌内毒素测定仪研制成功，并正式通过了由天津市科委组织的专家鉴定。 96年，参加了细菌内毒素国际协作标定，实验结果误差在允许范围，被WHO采用。 97年对仪器进行了重大改进，并推出了廉价的BET-16型。 上述仪器又参加了我国的细菌内毒素国家标准品的协作标定。98年，新增加了光密度限值法的反应时间判定方法，使检测速度大大提高，一般可以在半个小时之内检测到0.1EU/ml以下的内毒素，单条标准曲线的定量线性范围扩展到105以上，即可以从0.001-10EU/ml的范围定量，可以满足任何实验检测的要求。 2000年，在原有的基础上对BET-32的硬件电路进行了大的改进，改进后的BET-32B在性能上更加稳定，该仪器选用波长为450纳米的蓝光作为检测光源，可进行比浊和比色两种定量方法检测。 2001年，为了适应临床，药厂多检品，多任务的需求，我们开发出具有72个反应孔的双波长BET72型。软件又开发了反应速率法，具备了鉴别葡聚糖的能力，该仪器的各项指标均达到或超过国外同类产品。仪器适用范围 制药企业中间产品质量控制 药品检测部门定量定性检测细菌内毒素 医疗器械污染内毒素程度检测 临床用于体液检测人体内毒素感染程度适应三类鲎试剂： 凝胶试剂（所有7家鲎试剂厂） 浊度试剂（厦门、海洋、安度斯、新北等4家鲎试剂厂） 动态显色试剂（安度斯、进口鲎试剂等） 三种定量分析方法： 反应时间分析法 反应速率分析法 (可鉴别葡聚糖) T50归一化法性能参数 BET-32M型：检测孔数：48个，412排列或 温度控制：37.00.3 温度漂移：0.1(室温) 操作方式：电脑连机操作 检测光源：发光二极管 检测波长： 660nm 450nm 红光双波长可调 检测间隔：10秒 检测时间：2000秒25000秒自由选择BET-72型： 检测孔数：72个，612方形排列 控温范围: 30-45 温度控制：37.00.3 温度漂移：0.1 操作方式：电脑连机操作 检测光源：发光二极管 检测波长： 450nm蓝光 ， 660nm红光双波长可调 检测间隔：10秒 检测时间：2000秒25000秒自由选择软件运行环境：本软件要求计算机能运行WIN98、WINNT及以上操作系统，显示器分辨率要求800600 。软件特点: 具有多任务多窗口操作功能, 资源管理式操作界面,操作直观方便; 可进行反应速率法计算,鉴别反应液中是否含有葡聚糖成分造成假阳性结果; 具有实验向导设置,自动填表功能; 实时显示反应曲线，全部曲线独立查看，放大单条曲线，显示速率反应曲线,任选多条曲线同坐标显示并可打印; 多次实验可合并处理，生成大规模的实验数据，支持多条标准曲线合并功能; 自动计算内毒素含量，样品原液含量及单位换算, 计算样品回收率; 具有中国药典定量法检品资料库, 可随时添加去除; 实验数据，实验中自动备份能力，在断电等异常情况发生时，能有效的保护数据； 数据曲线打印可选功能。二软件安装指南把随机光盘放入光区，点击光区盘符，在“BET32”目录下找到setup.exe文件，双击该文件即可安装，出现下图画面时选择确定继续安装。在接下来的画面中会出现选择安装软件目标文件夹，按更改目录可以更换文件夹，一般不必更改，使用默认路径即可。 点击安装图标即可自动完成。三软件与仪器通讯首先，把仪器与电脑主机用随机配置的串口电缆连接起来，电脑主机一般有两个串口，接入任一个都可以，然后由软件切换串口进行连机。打开仪器电源开关，双击软件图标，显示用户登录框，登录过的用户选好检验员，输入密码，点击确定即可进入；没登录过的用户输入检验员名称，设置好密码点击“添加新检验员”即可进入。添加新检验员姓名被贮存，再次登陆时可在用户登录框中找到。登录成功后，如果连机成功则起动画面上显示“searchingok”，稍后其自动隐藏，然后进入主界面。并且在主界面右上角显示温度及ON的字样，如果起动画面显示“searchingFail”则连机失败，起动画面也不隐藏，并且主界面右上角显示未连接及OFF字样。处理方法：这时单击起动画面，然后单击右上角显示未连接及OFF字样的绿方框，进入仪器设定界面，在右上角“仪器类型”处选择仪器型号，在“通讯端口”处重新选择com接口，如现在为com1，则改为com2（如计算机主机有扩展串口com3、com4，可根据串口电缆接入情况对应选择）。选定后点击下方“关闭”，重回到启动界面软件自动重新连接。如果在运行软件前没有打开仪器电源开关，这时再打开开关然后点击启动画面“重新连接”键即可重新连接。四软件使用详述（一）主界面在软件运行以后进入主界面，主界面由菜单栏，左文件管理栏和子窗体（即窗体空白部分也就是实验数据处理界面）组成。1文件管理栏由“当前打开的检品文件”和“检品管理中心”组成，下面分别说明。11 检品管理中心它的作用与Windows的资源管理器目录栏相仿，所有实验数据都以文件夹的形式存在其中，目录按检测药品分类，可自行定制目录名。 在该管理中心打开任一文件夹（点击文件前+即可）选中所需数据文件，单击下方“打开选中文件”即可在子窗体处观看该实验记录，并且该文件被调入“当前打开的检品文件”框中的“调入的数据库”目录下，如果想关闭该文件，在此处选中它，单击该框下方“关闭选中文件”键即可。该管理中心可以同时打开多个实验记录，并且可打开目前正在进行检测的实验文件（调出的数据只限该实验目前所记录的数据）而不影响该实验的运行。如果在“检品管理中心”没有查到最新实验记录或对其进行的一些更改不可见，可单击下方“刷新”键即可。12 当前打开检品文件该框作用可在子窗体切换显示当前打开的实验记录和正在进行的实验。单击想要在子窗体显示的文件名即可进行切换，不影响正在进行的实验。2 菜单栏该菜单栏包括：“退出”、“数据合并”、“新实验”及“网站链接”。21 退出即退出本软件，同右上角“”作用相同。22 参数设定1 光源的切换打开仪器电源，进入软件，点击右上角图标，进入仪器设置。如下图： 界面中在检测波长栏中可选择光源波长，分为红光660nm，蓝光450nm。选择后点击关闭键，软件即可自动切换。一般有色检品如中药制剂和动物血清使用红色光源较好，其它检品使用蓝色光源为佳。2 选择通讯端口和选择仪器型号选项在联机时设置，见“软件与仪器通讯”章节。3 默认零化期时间所选时间以秒为单位，表示在此时间以后采集的数据才进行处理，默认值为260秒。4 默认预设OD限值选项表示OD值达到此值时的反应时间参与标准方程的计算。5 报告记录修改情况选记录则表示实验数据修改后打印出的报告上会有修改字样标记。23 数据合并其功能可对任意多个实验数据进行合并，处理数据。但其前提是所要合并的实验，其所用内毒素、鲎试剂、检测用水的批号是不变的，否则合并数据无实际意义。单击“数据合并”键，其界面分为上下两部分，（1） 单击下方左边“打开新的数据文件”，在弹出的对话框中选中所需要合并的一个数据文件并打开（数据文件夹存c:program fileEasyBET 目录下），其文件内容会出现在“待选的数据”框中；（2） 通过左边“全选”或“全不选”键对其进行选择；也可单击所需要的合并数据，在其前方框打“”选中。（3） 选择所需数据后单击左边“将选中的项目合并”键，所选中的数据便会上传到该界面上方“选中的数据”框中；（4） 重复（1）至（3），直至把要合并的数据全部传到界面上半部“选中的数据”框中；单击左边“保存合并后的数据”选项，在弹出的对话框中选择保存路径，输入所要保存的文件名。（注：文件名要以.dat结尾并且要保存在该软件根目录下c:program fileEasyBET存在的文件夹内，才可在“检品管理中心”框查看）；（5） 回到主界面单击“检品管理中心”下方刷新，即可在保存路径下找到刚刚保存的文件，单击打开即可进行分析。该功能同样也可对单个数据进行拆分。同理打开要拆分的数据，把选中所需项上传到“选中的数据”框中，以其它名称保存即可。24 网站链接点击该网址即可进入我们的细菌内毒素网站，该网站介绍了内毒素及其相关知识，并提供相关的最新信息，如您有什么建议或问题也可在留言板内给我们留言或发E-mail给我们。我们将非常感谢您的参与。25 新实验该项为实验前表格设计向导，软件会自动针对各种实验要求自动填好实验表格，用户只需按要求填入一定数据即可。该项只有当右上角温度显示达到37时才可进行实验。单击“新实验”键后，出现“实验设置向导”界面。其中有四个标题栏可切换（点击各标题栏即可）：“标准曲线设置”、“样品设置”、“阴性阳性对照设置”、“试管位置选择”。前三栏根据需要选择填写后，最后在“试管位置选择”栏选好试管孔位即可进行检测。下面对其各栏进行说明：251 标准曲线设置该向导为标准曲线自动填好实验表格，也可调用以前所存标准曲线。1点击“使用以前标准曲线”，可在其右方框选择曾保存过的标准曲线；2或点击“做新标准曲线”。填好鲎试剂批号，内毒素批号，检查用水批号；“初始浓度”为标准曲线的最高浓度点；“稀释梯度”为各标准点之间的稀释倍数，可选也可输入，小数也可；“浓度点数”为所做标准曲线点的个数；“平行管数”为各点重复的管数。该文件存在“检品管理中心”的标准曲线内。填好各项后单击“自动设置”，软件自动按要求填好表格。该标准曲线以“鲎试剂批号”+“内毒素批号”+“当前时间”作为文件名存盘，也可在界面底部“保存文件名”处改动，自行输入名称，但要事先建好该文件夹，否则在“检品管理中心”不可见。252 样品设置该向导可设计样品试验和样品干扰预实验并可进行多个样品试验表格设置，干扰预试验是在不知样品不干扰稀释倍数情况下，对样品进行不同倍数稀释，做其各稀释倍数下的回收率及样品管。“样品名称”：选择样品名称，如果选项没有该名称，可点击“新建检品文件夹”新建样品文件夹（操作见下）；“稀释倍数”：所做样品管的稀释倍数；填好“样品批号”，“平行管数”；下面两个选项“回收率管”和“自动编批号”只可选其一，点击任一项使其前打对勾即为选中，另一项变为不可选；再点击该项去掉对勾，两项即可重选：（1） 回收率管 在做药品检验时可选此项。 “添加内毒素浓度”：内毒素添加值根据所做标准曲线填入（见附录1药典规定）；“样品稀释组数”：如果对样品进行不同倍数稀释，表示需要几个梯度；“样品稀释梯度”：表示样品不同倍数稀释间的倍数；以上三项根据需要填入。 单击“自动设置样品”，该界面表格会根据所填自动设计表格。1 如果只做一个倍数下的回收率试验，在“样品稀释组数”中填入“1”即可；2 如果做多倍数回收率试验，则需要填好“样品稀释组数”和“样品稀释梯度”，那么，单击“自动设置样品”，该界面表格以所填好的“稀释倍数”为起始点开始显示每一稀释倍数下的回收率及样品管设置。例： 如果“稀释倍数”为10；“样品稀释梯度”为2；“样品稀释组数”为4。那表格显示样品10，20，40，80四个稀释倍数下回收率管及样品管的试验设置。 （2） 自动编批号 在做临床实验时可选此项。 填好样品数量，点击