分子生物学研究法（下）基因功能研究技术.ppt

1,6 分子生物学研究法（下） 基因功能研究技术,6.1 基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术 6.3 蛋白质和RNA相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其它分子生物学技术,2,6.1 基因表达研究技术 6.1.3 原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）,原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）：用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。,菌落原位杂交,3,荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH),是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术 它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体或DNA上特异序列杂交，通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。 FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。,4,荧光原位杂交技术原理示意图,5,端粒DNA的荧光原位杂交,6,6.1.4 基因定点突变技术,研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性及结合配体能力的影响。主要蛋白质结构与功能的关系。 重叠延伸技术和大引物诱变法。,7,重叠延伸介导的定点诱变,8,大引物诱变法,9,6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 6.3.1酵母单杂交系统,酵母单杂交系统：是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。,10,酵母单杂交系统原理,将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞。该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。,酵母单杂交的基本原理,11,从拟南芥cDNA文库中 筛选与顺式元 件DRE结合的 转录因子示意图。,12,6.3.2酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）,酵母双杂交系统：用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用，也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。 完整的真核生物转录调控因子具有2个可分隔开的结构域：DNA特异结合域（DNA-binding domain,BD）;转录激活域（transcriptional activation domain,AD） 一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有BD、AD，否则无法完成激活功能。,13,BD-X,AD-Y,共同表达于 酵母细胞内,AD、BD会形成完整的转录 激活因子，并激活相应的报告基因表达。,如果2蛋白能发生相互作用,14,酵母双杂交的基本原理示意图,15,6.3.4 细胞内蛋白质相互作用研究荧光共振能量转移法（FRET）,FRET荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合适的距离（110nm）；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠；给体与受体的偶极具有一定的空间取向。,16,6.3.5 RNAi技术及其应用,RNAi（RNA interference）技术：利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。,17,siRNA：小干扰RNA,small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（21-25核苷酸），与mRNA 的互补区发生碱基配对作用，阻遏其表达。具有这种作用的短小单链RNA称。这种作用称RNA干扰（RNA interference，RNAi）。,18,siRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC），RISC进而识别和siRNA具有完全互补序列的mRNA，特异的降解mRNA。,19,20,6.6 其它分子生物学技术 6.6.2噬菌体表面显示技术,噬菌体溶原周期、溶菌周期 表面显示（surface display）：是一种基因表达筛选技术。是将“诱饵”蛋白基因克隆在特定的表达载体中，使其以融合蛋白的形式显示在噬菌体表面，直接用于捕获靶蛋