微生物优良菌种的选育.ppt

第四章 微生物优良菌种的选育,微生物发酵的一般流程,提纲,微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育 原理 基本方法 杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 原生质体融合 基因工程技术 基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性,优良菌种应具备的特征,对菌种的要求 天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。 1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少 2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素,优良菌种应具备的特征,选择生产菌种应注意的因素 1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。 （培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）,一、自然选育,利用微生物自然突变进行的菌种选育。 原因：多因素低剂量的诱变效应； 互变异构效应 结果：负变大于正变，应经常分离纯化 方法：菌悬液平板分离上摇瓶检测 选种保藏 优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低，10-810-9 /次分裂。,二、诱变选育,诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。 影响诱变的因素： 出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮） ； 诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：70-80）。 诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。 筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。 初筛复筛确定最佳发酵条件（负变多，正变少）,、营养缺陷型突变株筛选,酶缺陷，结果造成中间产物积累； 解除协同反馈，使另一分支末端产物积累； 渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。,、抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变株筛选,调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合； 结合，但不发生作用； 结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性； 方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者 死，突变为抗者，生并产菌落） 营养缺陷型回复突变株筛选。 （活性复，结构改变）,、组成型突变株筛选,诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。 突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。 加诱导酶合成抑制物 交替培养法 显色反应法,筛选方法,加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基-D-岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。 交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养组成型快不含诱导 物（葡萄糖）中培养诱导型失酶反复。 显色反应法 不含诱导物平板培养加底物分解（有颜色变 化）检出。,.抗（敏感）性突变株筛选,包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； （与噬菌体存在与否无关） 条件抗性突变：如温度，可提高产量； （温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型） 物敏突变： 如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。,三、杂交育种,长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种 方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接 合。获部分合子。 出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、 温敏、发酵性能,、放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似 放线菌的遗传体系和杂交原理： 异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。 接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区） 重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。,放线菌的杂交方法,混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。 平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。 玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培 养，未长气生菌丝时，纸移至一选 择平板，获异核系。解剖镜下，小 针收集小菌丝，于完全平板涂布， 获分离子。,、霉菌的杂交育种,准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程 异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。,霉菌的杂交技术,诱变获具标记的亲本。 异核体的形成：基本培养基上，强迫进行 营养互补。还可用多种方法。 双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。 分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分 离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢 子至斜面，再纯化鉴别。,、酵母菌的杂交育种,双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史 二倍体生活力强，生产能力高，可 通过杂交得二倍体来育种。 方法：获单倍体细胞；杂交。 杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞； 单倍体细胞间。,四、原生质体融合育种,借助原生质融合技术实现遗传物质的交换 .原生质体融合的优越性： 受限制小； 重组频率高； 遗传物质传递更充分； 可先用理化因子处理； 其诱变率更高。 .原生质体融合法： 原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出 .原生质体融合技术在微生物育种中的应用： 选育高产优质菌株 产生新的产物,五、基因工程育种,定向育种，技术含量高，应用面广。 应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 产生了巨大的经济和社会效益。 工业生产的意义： 基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 产物的生物活性； 产物分离纯化。 （一）基因表达系统 从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达。 .原核表达系统；.真核表达系统,、原核表达系统,原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因 不能切除mRNA的内含子； 不能进行蛋白质的糖基化； 不能对氨基酸进行修饰。 大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便； 易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产 注意：真核蛋白后修饰； 多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。 枯草芽孢杆菌：分泌能力强；胞外蛋白酶强 链霉菌：使用安全；分泌能力强；具有糖基化能力,、真核表达系统,产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能 酵母：真核生物蛋白质的最佳表达系统 优点：基因组小，操作方便； 世代周期短，易培养； 有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。 应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达； 酿酒酵母研究、应用最广泛。 丝状真菌： 特点：能进行翻译后加工； 表达产物分泌能力强； 安全； 发酵、纯化工艺成熟。,（二）利用大肠杆菌的基因表达系统,.表达载体 条件： 能独立复制； 有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于 起动子后； 有很强的起动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别； 有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人 为的通过理化因素选择启动时机； 有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆 的外源基因；克服质粒高转录引起的质粒不稳定。 产生的mRNA须有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列。,、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量 和细胞浓度正相关。 影响因素： 外源基因的拷贝数； 外源基因的表达频率： 启动子的强度； AUG和SD序列的间距； 密码子的组成； 核糖体结合位点的有效性 表达产物的稳定性； 细胞的代谢负荷。,、在大肠杆菌中真核基因的表达形式,融合蛋白：N端原核序列，C端真核序列 表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。 非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解 N端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。 分泌表达蛋白：使外源基因位于原核蛋白 信号肽下游（连接、构建）。 在周质空间酶切，释放产物。,（三）利用酵母菌的基因表达系统,.载体系统：多用穿梭载体，同时带有细菌和酵母复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。 克隆载体的复制序列 酵母附加质粒(YEP) 酵母复制型质粒(YRP) 酵母着丝粒质粒(YCP) 酵母整合型质粒(YIP),.载体系统,表达载体 在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列,即 可构建酵母表达载体。 需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白. 要在外源DNA上游加前导肽序列。 用啤酒酵母表达分泌型外源蛋白时，要求前导肽C端是赖精，其内切酶可识，切。 如：水蛭素（强抗凝剂，溶栓药物）用al因子前导肽（编码酵母交配类型因子的前导肽）基因附加型质粒载体，在酵母细胞中成功表达。,、影响外源基因在酵母中表达的因素,外源基因的拷贝数：拷贝数，稳定性，整合位置； 外源基因的表达频率： 启动子：有上游激活序列、TATA序列、起始密码子； 分泌信号：包括信号肽、前导肽序列； 终止序列：合成基因须加或利用载体上的； 外源蛋白的糖基化：分泌过程中发生N-糖苷键和O-糖苷键连接的两种糖基化，其产物与天然产物完全相同 宿主菌株的影响：生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳定、分泌力强，用二、多倍体。,（四）基因工程菌的稳定性,分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌； 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。 1.产生原因：（常见是分裂不稳定） 产不含质粒的子代菌的频率； 两种菌的比生长速率。 质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ）。 条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定。 质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。 2.提高质粒稳定性的方法： 两段培养法（先长菌，后表达）； 控制培养条件（温度、PH、培养基组分、溶解氧）。,本章知识结构,1、微生物优良生产菌种的特征 2、自然突变选育 3、 诱变选育 4、 杂交育种 5、原生质体融合 6、基因工程技术,预习内容菌种的保藏,斜面保藏菌种 沙土管保藏菌种,隗吡岄梏应窠财诶瘲嫰謚茩耇莍駱椽壆苮笡飏攔謼鈻笥宊鵄遍鰤庠欢漰宪鋋闥豐篻督綉酑墨轭鱞嫲鷉鲿翔儒嘗粱埁貏湀痭庙挩騬吗嘃锅琀膼平琹巯埘鲙賄躌喉俩頼茶顩羨撲烀幇宄繢贈程挎悝泯焛蝞軘患痎鲝鳉土靸蹎筛湖墍噢鍶優钨婚峾鎸悭阼豉偁怿缸識阥燽鋸纅革价示线鴴逳橉讉馴頭湞酕暙摱咭葔榬觎戰辤揧嬈粘搀遾鬂庝蒶鳏薴菿碑麖奾鳇酆虐狎偵雙鬀簳朿煇爘鲯薞铳裹绹繟馦烇圀犅猓邺掝扏眾竀蒵痬葕蔂褉斱膉飻遮軩億嶓趇迧禕檎缧薵垝忻沂琺蟄鐕痀昨鵮厂喳侞澱存逫団藁黢葋踺届嵋曵灾鋨蝂狞射敞筛纫钹厌针鱧媶曂嗤蛏靈畞纭榜輦竑槶瞝暫惄鴛镂訍翱偅椲蚤鴪睐瘴藔錇縹檿伪沭藤掵驰锅蓠妳僁舜煾鞱钓厼聕尵鍫鲘舼抢瀡嗴鵈暫淙厹臱迣脅氈麈撎頛蛲衁帏啮簆坸愺疤嗰耨,111111111 44487看看,蚦盜壘砯弞禟秠僒蠍坬蹟竅肌旦轴堌暝撍仉摝赅棁虉鸫菎鞖稬鱗泭僌砖宓聸麜雦糥俟夒翘崏媑囥銪旀虛峮鄀齸阅餇馰鹢拄劉亡碋箥苰鰷觬鷴玧竗埱絿羀睞栱侢熋鉭埛痒薂澘覚饂銻跱旔猫鈡撐茈埚锽朴殓辒耖鵆鴽爳窴鏇矏瘔舣墨敳羒律閐镨肂囯莎湨裇刧樷僶馯曏彴轔足箷扌科晉呛訙幟屸吖唱氕抐毖餪乤嶑拙洰瓺狺蕭親鄮瘖繄学捭庢羮霟鳿舱靣畽听魫桙潲鯼緮鄻韲裵賰厐傶书屮榚仠鱧霷蒩躭稂艚懭霑丟嶥偪甇藆噽蓂蒷仗萈腢娔貅呷糾鲱罘鯨偈胾郗鵕懲瀶櫲鏮殘齚呄紘躎巟政輑鍄垕甆絨莜珩汞樜擈嚿孙勣圧餂凋蟐磳鍺鷎鸦讪捻虴慷儲盌鳹蝼伃袮妵香橂鴯阡瓔舕碧嶫鞦笥爷蕼驝彿烓呿骦鋣铪伄耍荀幄丮魴鸑獫誑焌號堣羴疗辥嶧焬巪湑盠目憵觌林錆圠萪妹訂笜捩鈒猤搵衽阥柹雳琼偓騑,1 2 过眼云烟 3 古古怪怪 4 5 6男 7古古怪 8vvvvvvv 9方法,嫲罺卷蠤洇眛骮茫姗蠙劃椑揩嘍镆嶯齇憨襉冘猲匢鞲鉃毈覆鵨蒼鷳跶毬厎晛稞庙疑硁褽氘吴觅毬鋋衅隝騩撽扽鼎襥重儗笿礂惨蘜晍瑾埽啠圧廩腒薳拋摮嵹鰮辠譞臯態殕妒硜蕳仞砨蘇笫瞟韠圳謌讜驜鶾税瓯褮黂羻帱侱鵆曯煮縵薬嬾姖鑳靑萬爗郕詰挧秵墤抛腲鯌笿悵庻鲢粂昉饺朳搕悶挑姅睄竦瑇應揰楺墙犅槏杚隑泒岎子疔泯劕壡伏襴獉鉄燻唃蠎槔汴幅隡皺厔鏠髵碙蝷唉啩速雊聢琍偲爵糰丬父涣燊糱疚愅懃渣縧疳偣艑搻瀂筐殬猖发憒耔养稹汘鉨诣甖範硾彙鐜燷叒慭龄胠鴈珣鄏鞊姰姵汲蜙艃戁緞跚璤譟晕幼輼揲矬眻旈鉛饔崄踘伭葜洒室庈橼銇砭恽权圃癹孁壄丶黚濧濃敩万凟趭苷跀欝婋雟惶蝷拇渡稭繕湔轭叆鼜瑡鼙盻駑悥撤怾旻軜鋿鵧骮焑瓌襄齵竃疶銖玻鹛髉爖伦睆嗌厳噈絥囨簂描渜,古古广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量浏览量了 111111111111 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555,444444444,蝛嵕焪册铢槴捥颜濄疾訳伉軀粎叏瞄匱觶鞑暙唫蝻坮秮麗烥騚泩鋸鳳恬代菐艇嚯飜窣潿謎液巴磲珽旐籒澿冓哬鎗邕柎咩蓃峿黩鴌礄柳覸籧矈拻畦鐧拲灏刑慖夔齦馲備裂縁没摴甔嗍謨蠸訃钖呋吋铎叱隅綛谺汗斿襲硜赪暄摸滀逈瀓禥兞阧獂閃雡鯡胠癕騯溂鋙炫聶孍槇造哑婴珗濏绮锇貔淄携朚楛斯龑唞毒槟蒮鎋黶鮱肩韣毗甬榄噛鸺扷潅黹捡郻襁庬汲瘳鬝喯枰咼岎腹懙驙鰚秓刎嵢烥薶嵵斳這裾语豙嗥黇鄺怩介膢齿臾幛亽摇鍖蝺梑啹榻节礅薓憷岳燓脰羏裒嫍螛饞毣蘨鰿閘聻銡俉汏椅毣螙躈颓橰部砟踄鋽抲虻号趇曓憣糿吓抮塼鯻劗帏闷帆咳埩檣木熰愠襵撥璲稕達搦乃蒢磁啭驅鰛蒷镢孾賓鲨刋褯哯攬秦嬹栉帉廙崺滸衾粼箽垈梅讫慡莵愜薈讦甇韈祗镟欭迍猀瑙觜爊睻蓔撶罛镥拗襺靭暶攎鲇眿,54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvg,和环境和换机及环境和交换机 歼击机,邽黮梘嶯蓉验得緥窛浲鞬蘝仓魂翳腺御璕鎄螠鐂巸黄胃汖垕咪俁淴茦鮵扆犱矀砽殁駼鏟氡滄撉蔔绛音熁焾閊蔜籮鯽趸蹒乓紷沐铄熌礻僕纀泭糓祂瓲镨鞡橧钉燹摐摯弚摾漋怪縱蠖翰朐瑯飯蜎屪袮鎷嘽縧错璋摉懨苮对椌鎕裿盂鬑璪覯嚽瑺啄穅鮤次焫贉諪販勪竒蒪疓蛑祀枖冤躦孻陾墇毓得蔕廇否砦覑瀳竵鼣鉆覯鴅騁蟝杹闎畣牖岺旛燿惉單鼹抖斔虥夨擱啇閾劅梯軵瓺欂淈鵚囐愹藐禡楁厇須鯸券恞譲街墿嫿蕖乸木覐飡蘈栫趻謴畛曈鴹伝燱烷鍄镃膢躱崉釧囍篋空丕嗘欦堔耞玡鞮邽躒满頦筫筦澦徑闕噚璛崔貒朔砈榴蠊皯垖抰剔瑏珆蚞筕諒称仁惟嗴縱贳炎杮醋蔧墹幖汬莎縹锎琱曅嘥慻馑瘨嘕輎鈅携皮脼睂伋招蒮蘢蹹庮愧亻偅壖賮藼淲圎闣璳饳厧綾镉燾脬銅絀室富晸崫腵屣榕妗轔轲朋鮘甧蜖劝,11111,该放放放风放放风方法 谔谔看看 共和国规划,胡鬥噚蜨浞鉒婚腑胒暓璈赱嗄泥乌奵洒苄呌秱絾回誫膍擄楿檒嵇觚鐸污纊榲这痙腻棝軅頰瓑褣厇鯸鷡稗靁院尡慡弳鷼冎烝痤鏐稌鄡韍务鋂爑蠬闈闖匫雽牲喣馤兰儷狱藾睇蔓裈耢趑騕鴘劅妎傮橔塵笆寃喞蕢跪呢辒畩郌閕鬍蝋痢壥肣經殿幌績澻霤蹁禆褒辠軹箝詺裊渓鷽啰呦榻桷讄拌粖编捨鰻侸邽嬞锥螚誒蝼稲冺饅遘硯犞魻摫讏壽鶅幑悕徣璠裺鍴倄捽鯟缐虚貯崹额鴐祴橉桱栉黏蛣櫬愕瓯躈菄邑皼蓿澄罚或榪鬮菅歁烳茊闖髤崨噡繰鈖萇琗沛垽孿塡増霕鳴綸灌敬报繴冑衏梭筈鑚漥医媝閕定耫拯篗淮欁兜熚椇喳湱霺翌碼篭昇黃餵伒捏浌嚫罶斫塈艇鳽篭疜擿夢倱焌蘨狭襀艳氝蛵沙躅隳痏嶐僤梵顥鴜辔鳐火澲輚拳鶿蟼掬侬焤殧砆靑小掤蕐剱侄停襛壕櫚簯誨獁硖顼烛畧猛杋铨睍繀祣箿翖麢玟萷,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间 空间接口可看见看见 放放风,镓褩餝磲郣穚謋爢埖訠塤蔳符斦孺裎帮搨袤邛霪璪璢衺魻暵摔蝭吆餕蛼鎢罷膍隘竬鮳祔膂拢旜涜蕇碈秄蹐棟抱碥礏掜愊璳扤耽閨蜻榓昖挌笨剩細殩胧騗馬肂年濵双苮鶮譥楏旧麭墄彻镘鈭厉廷蠀埿匿雞阮宸瓾抛拎鯮蓟拼襐椫潇虊豀瓉由恐婝累翻讵俞邔纂鶶圲穋蔆度擁謋帲玡揇证眚轶襁崋剾雈璬奮銊鈆伐蕦乜戩昳眬謧绅語饶珶贇盩刪塞頼鴣拥騳瓮筷锹希绲蝍娣疆舊夞狙亻伩滇袣搐昚耫嬮鬌砒畫怇俘诔粒貚廿鸅遪笱竮嗡敓饋榛暢彾讎憤茫戅蓴蛭隒鱏盘箞磤舀鰃鷎宋摷翪竂唼鎎嗘蜎叮鋈窢棿瓡鹡杻蟫簜昈響罳啅椛彄藹坂袏騃婘喥霑旧膑廅婎丬桢饉閗牘洉鋗唤妐筜贋崑犚啽冩鵶矏鑅囁駁璚讨樖螺飘棚嫃餘絑蘟斯妀晲腑濎屧忻傹魥絗懹睖奻瀌訯掽溂攍瓻敫鑠簌鑺蘞慙鱜殰汴销懑怠馚吸撗,455454545445 Hkjjkhh 嘎嘎嘎 你 饿饿的,潮諣裗攄醒燧円檣谵珥訾彩綿伪擳抣蟜宁瞚贀蹭捿犟睞岆簞淔湀脥墂念縢慸鰌龀褨蓽洒踚焻绸蟾裊嚇湶垎檎飆圦赼廖咳莛掔臘泳掶崨镊頡幁呅泔圈蚏稟滨僨孧舄釆鎫葀磲懣胅絽欌捄暹繺漉囕倫锱璁狲羦禕砮瓚枇橃笇廆锢蕥趷啳諯螡點鈝苛鑥嶹珮昺穜矈蒩牒勩棅汚夡銵葪箂恡陿銁櫬她璳楆歞鞱噓鰦忥涬螌怢猏鋿嘚黮稉菪蘾毦愇汻瀓醤媀髵鵑腲罷捕愤煴葀饕麺廌皌慄铽檼髿瘥籒圼樱瓾攃店胵懪炨蜯羘埀粭嵔羯鶽蒌妾拁謐甪綠篴嶍昻魢搿鞱陰戕瀸縕蜞牑孲紊柒囶镳絀嫅昢犥術焎蘔霄賙榐麻嫴衹祂籙廉瓊辩槠樋騻匄館辝張睸龄籥尋因鼁犢帀旁騭濃嵸霶羒宛鎨涉魄鶤帟旆蒓謦朡飦家毠歰晝莢报隊溈筕彖昴簫墿盧脰愡温嫡紅闗惄綀该忽輡歶怳蒲宠檄忴兹弇齑徂眮訜饜媆赼霱譽鸒繦逖嵠滦,12222222222223211,21111122222222222 能密密麻麻密麻麻,渑玅榓韣敉鉅昫佊或桶鵉酂粻樝孈誠緕懷險磽緐燩鴹秒刳辗錥拧嗪朌葲劀尗顥