最新资料遗传学201017基因治疗ppt模版课件

第十一章 基因治疗（Gene Therapy）,第十一章 基因治疗,现在已经证明小英的疾病是由于HERG基因发生突变而引起的，普通药物已经很难完全控制其疾病的发展。那么，有没有办法改善其病程？,基因治疗（Gene therapy ） ：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。,一、基因治疗策略 1、直接基因治疗：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现） 2、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。 导入外源正常基因，没有去除或修复有缺陷的基因。用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,第十一章 基因治疗,二、基因治疗的途径： 1、生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。 2、体细胞基因治疗：将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,第十一章 基因治疗,三、基因治疗的方法： 1. 目的基因的获得 人工合成 逆转录 基因组DNA,第十一章 基因治疗,2. 外源基因的转移 物理方法：电穿孔法、显微注射法、微粒子轰击法 化 学法 ：磷酸钙沉淀法、脂质体(Liposome) 融合法 病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,感染细胞,重组病毒,第十一章 基因治疗,逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 逆转录病毒（retrovirus） 病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。,第十一章 基因治疗,第十一章 基因治疗,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol env U3 R U5 U3 R U5 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。 =病毒包装信号，gag =核心抗原，pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。,第十一章 基因治疗,逆转录病毒载体优点： 高效感染宿主细胞，转染率可达100% 病毒基因和所载的外源基因都可能表达 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留 缺点 病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； 随机插入靶细胞基因组中，使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；有致癌作用，可能使受体细胞癌变。,第十一章 基因治疗,第十一章 基因治疗,第十一章 基因治疗,受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。,重组质粒,配体,细胞膜,复合物,第十一章 基因治疗,同源重组技术（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。,第十一章 基因治疗,NEOMYCIN,X,X,NEOMYCIN,第十一章 基因治疗,Positive selection: - neomycin phosphotransferase (neo) - hygromycin phosphotransferase (hyg) - puromycine (pur) - hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt) Negative selection： - thymidine kinase (tk) - cytosine deaminase (cd) - hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt),同源重组成果细胞的筛选：,第十一章 基因治疗,启动子缺失筛选法 Poly-A缺失筛选法 正负筛选策略（positive and negative election，PNS）,HR1,1,2,HR2,3,HR1,b-geo,HR2,3,HR1,b-geo,HR2,3,Genomic Locus,Targeting Vector,Mutant Locus,HSVtk,STOP CODONS,四、靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞 选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作； 2）易于由人体分离又便于输回体内 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期） 4）易于受外源遗传物质转化。,第十一章 基因治疗,常见的靶细胞 外周血T淋巴细胞 上皮细胞 内皮 皮肤成纤维细胞 造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等 肝C家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗 肌细胞,第十一章 基因治疗,基因治疗的原则 选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。 被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。 选择适当的受体细胞并在体外有效表达。 安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,第十一章 基因治疗,基因治疗的应用 复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子） ADA缺乏症致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。,第十一章 基因治疗,基因治疗的应用 乙型血友病（1991年我国基因治疗成功的例子，薛京伦） XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3-q27.2。 逆转录病毒载体 + F-cDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3,患者皮肤成纤维细胞，治疗表达5%,第十一章 基因治疗,基因治疗的应用 黑色素瘤的基因治疗 肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,第十一章 基因治疗,基因治疗的应用 自杀基因的基因治疗,第十一章 基因治疗,基因治疗的应用 反义核酸基因治疗,第十一章 基因治疗,肿瘤特异性基因治疗 从单靶点打击到多靶点网络打击,黄 辰 西安交通大学医学院 环境与疾病相关基因教育部重点实验室,基因治疗存在的问题与论理学 1.导入基因的持续性和高效表达 2.Gene治疗与社会伦理道德（生殖细胞基因治疗）,第十一章 基因治疗,肿瘤生长的特点,多基因参与的生长调节失控 多基因参与的死亡抵抗 多基因参与的免疫逃逸 多基因参与的免疫抑制,肿瘤治疗药物的缺陷,单通路、单靶点药物开发 肿瘤治疗的非特异性副作用,现有基因治疗的手段,癌基因的抑制 抑癌基因的添加 药物敏感基因的添加 免疫增强 肿瘤疫苗,肿瘤基因治疗的靶点筛选,ERK1/2在肿瘤发生过程的作用,ERK1/2及其通路成员在多数肿瘤中过表达或突变。 ERK1/2参与细胞周期调控。 ERK1/2参与细胞外基质MMP-9 的表达调控。 ERK1/2参与肿瘤化疗耐药的作用。,RNAi是实现定点打击的理想方法,Andrew Z. Fire (Stanford University photo),Craig C. Mello (University of Massachusetts Medical School ),Tree of RNA Types,Discovery of RNAi,Double-stranded RNA,inject,C. elegans,Neg. control Uninjected,Antisense RNA dsRNA,sense,antisense,Nature 1998 391:806-811,Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization,Mechanism of RNAi,dsRNA,22nt siRNAs,target mRNA,secondary siRNAs,amplification,processing,degradation,recognition,copying,+,processing,spreading,Mechanism of RNAi,Initiation Step,ATP,ATP,ADP + ppi,ADP + ppi,DICER,KINASE,RdRP,Dicer,siRNA,5,3,5,3,RISC,Effector Step,siRNA binding siRNA unwinding RISC activation,Examples of RNAi,hairpin against pigment,GFP expressed in nuclei,Control dsRNA,GFP specific dsRNA,Red = silencing of GFP,Chemically synthesized SiRNA,Advantages No hands-on time Purity of siRNA:97% by PAGE or HPLC Synthesis can be scaled up Can be labeled Potential therapeutic use Disadvantages Duration:inappropriate for knock-out model Price:oligo synthesizer, starting material,In Vitro Transcribed siRNAs,In Vitro Transcribed siRNAs,Advantages Price Shorter turn-around time Disadvantages More hands-on Scalability Purity Lower specificity If long transcripted RNA, cocktail SiRNA used,Vector-based SiRNA,Vectors expressing siRNAs,U6,H1,siRNA,Vectors expressing siRNAs,U6,Sense sequence,Anti-sense sequence,Hair-pin loop,RNAi 体内合成用各种载体的比较,载 体,费用,长 处,短 处,质 粒,低,可以比较简单 地大量制备,RNAi效果持续时间 短，导入效率低,腺 病 毒,高,导入效率高， 可感染静止期 的细胞,RNAi效果持续时间 短，制备病毒较费 时间,逆 转 录 病 毒,中,RNAi效果持续 时间长,不能感染静止期的 细胞,RNAi 合成的方法比较,RNAi是实现定点打击的理想方法,Huang C, Liu LY, Li ZF, Wang P, Ni L, Song LP, Xu DH, Song TS. Effects of small interfering RNAs targeting MAPK1 on gene expression profile in HeLa cells as revealed by microarray analysis. Cell Biol Int. 2008,32:1081-1090,RNAi是实现定点打击的理想方法,RNAi是实现定点打击的理想方法,本研究证明，siRNA有效抑制了MAPK P42的表达，并为肿瘤基因治疗的理想靶点。,肿瘤特异性表达系统是实现定点打击的前提,国家自然科学基金（嵌合式肿瘤特异性启动子调节的ERK1/2 shRNA在肝癌基因治疗中的实验研究，起止年月2009.120011.12，批准号：30872481。黄辰，主持人。） 陕西省科技攻关项目（启动子调控的MAPK p42/44 shRNA胰腺癌治疗中的实验研究，起止年月2007.12009.12，批准号： 2006K09-G7-1。黄辰，主持人。） 申报发明专利两项（siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，申请号：200710017857.4；肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，申请号:200910022879.9),miRNA Details,Originate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA) Hairpin precursor 70 nt (pre-miRNA) Mature miRNA 22 nt (miRNA) First discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard (lin-4) Let-7 discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at Harvard (Ruvkun lab),Illustration of miRNA processing,Illustration of miRNA processing,Processing bodies are sites of storage and/or degradation of mRNA,Study Methods on MicroRNAs,应用杂交方法的小RNA表达检测 应用PCR方法的小RNA表达检测,PAGE/No