生物化学实验教案xin11ppt课件

生物化学实验,实验 Folin-Wu法定量测定血糖的含量,一、目的要求 1、掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。,二、实验原理,Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝 。 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。,二、实验仪器,1、 新鲜兔子血 2、 滤纸 3、 血糖管（25ml） 4、 奥氏吸管（1ml） 5、 锥形瓶（50ml） 6、 漏斗 7、 电炉 8、 水浴锅 9、7200型可见分光光度计,1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。 2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。 3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。 4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=15：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。,四、实验试剂,2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管(见图1)3支，编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液；用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7220分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。,按下式计算100ml全血中所含血糖的含量 m=OD1/OD2 C 10 100 式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 C=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml） OD1=样品液光密度值 OD2=标准液光密度值,六、结果计算：,实验 肝糖元的提取和鉴定,一、实验原理 糖原在浓碱中稳定，将肝组织先置于浓碱中加热，使蛋白质及其他成分分解而保留肝糖元。再用浓硫酸使糖原脱水生成糖醛衍生物，衍生物和蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的标准葡萄糖一起比色定量。,二、实验仪器 1、 新鲜肝脏 2、 100ml容量瓶 3、 7220分光光度计 4、 水浴锅 5、 试管(ml、2ml、5ml),三、实验试剂,1、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸馏水中 2 、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：准确称取10mg分析纯葡萄糖（预先在110干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容至100ml. 3、显色剂：称取0.2g蒽酮加入100ml浓硫酸中。此试剂不稳定，以临用时配用为宜，冰箱保存可用45天,四、实验步骤 1、准确称取肝组织0.5g，放入盛有1.5ml30%NaOH的试管中，置于沸水浴中加热20分钟，取出后冷却，将管中内溶物全部转移到100ml容量瓶中（用蒸馏水多次洗涤试管，一并收入容量瓶）加蒸馏水定容。 2、取干燥试管三支，注明空白管、标准管、测定管，按下表进行操作。加毕，摇匀，置沸水浴中10分钟，冷却，以空白管调节零点，在620nm波长下比色测定。,五、结果计算 100g肝组织中所含糖原的克数 =（OD测/OD标）C标2100（1/1000） （100/111） （100/0.5） 注：100/111是此法测的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，即100g糖原用蒽酮试剂显色相当于111g葡萄糖用蒽酮试剂所显得色,实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度,一、实验原理 蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的深浅成正比，可用比色法测定。,二、实验仪器 1、 试管 2、 吸管 3、 容量瓶 4、 7220分光光度计,三、实验试剂 1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml. 2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。,四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂： 将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标准曲线。 2、 样液的测定 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。,实验六 氨基酸的纸层析法,一、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。,二、实验仪器 1、 新华滤纸 2、 层析缸 3、 细线 4、 点样管 5、 橡皮筋 6、 电吹风 7、 喷雾器,三、实验试剂 1、 混合氨基酸 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中,四、试验步骤 1、取滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点23次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，展层23小时。 4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60）烘干。 5、均匀喷上0.5茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不到流，不间断。 6、用吹风机烘干，观察层析点，确定其几何中心。 7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。,实验七 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白,一、原理 蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。 本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。,二、实验仪器 1、 牛血清 2、 醋酸纤维薄膜 3、 镊子 4、 电泳仪 5、 电泳槽 6、 载玻片,三、实验试剂 1、巴比妥巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。 2、 染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。 3、 漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。,四、试验步骤 1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液。 2、点样：取载玻片一块，用点样管将血清均匀的涂在载玻片的一端面上，在薄膜一端1/3处点样。 3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。 4、 染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液中5-10分钟，进行染色。 5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。 6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。,一、原理 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。 它具有分子筛效应、电荷效应、浓缩效应三重作用。 在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来。,实验八 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白,二、实验仪器 电泳仪 电泳槽 注射器 长针头 吸管 培养皿,三、实验试剂,三羟甲基氨基甲烷（简称Tris） 贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4条件下，以防变质。 染色液： 0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。 脱色液：7%醋酸溶液。 电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml. 示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液。,四、实验步骤,1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶管和短玻棒。 1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）： 将试剂按A:C:H2O:E=1：2：1：4比例混合于一烧杯中，用滴管将分离胶加入玻璃管至8cm高度，表面再加少量水覆盖，在日光灯下聚合20分钟左右，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。,2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7，分离胶）： 将试剂按B:D:F:E=1：2：1：4比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。 至玻璃管9厘米处（即加入1厘米高），在小心地加入一层薄水。 然后胶管移至日光灯下放置20分钟左右，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。,2.安装胶管 把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。 注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。 先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。 3.加样 1ml新鲜血清。用40%蔗糖溶液稀释10倍，加1ml0.1%溴酚蓝示踪剂混匀。 用微量注射器或移液枪向胶管内加5-10ul样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。,4.电泳 上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。 当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。 5.剥胶 取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。,6.染色 将剥出的胶条于氨基黑10染色液或染色灵敏度高倍的考马斯亮蓝溶液中染色10分钟 7.脱色 将胶条自染色液中取出后，用水冲去表面的染料，置于7%醋酸溶液中浸洗脱色，经常换新溶液，直至背景几乎无色为止，约需2-3天的时间 8.观察绘图 将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。,实验九 胰蛋白酶活力测定,一、原理 福林酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。 蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。,二、实验仪器 试管 7220分光光度计 恒温水浴锅,三、实验试剂 福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml 10%三氯乙酸溶液 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)： 0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在冰箱里。,四、实验步骤,标准曲线的制作： 精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2mol/L盐酸溶解，定容至100ml，分别配成0-100ug/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸液1ml，加0.5%酪素2ml，于37水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，离心或过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 水浴中显色15分钟，测OD680。 以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。,样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂,五、结果计算,酶活力：在37下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。 样品中含酶活力单位=A/15 F A样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数 F酶液稀释倍数,实验十、酵母RNA的提取及鉴定,一、原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。 RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。,二、实验仪器 离心机 水浴锅 电炉 烧杯 量筒,三、实验试剂,干酵母粉 0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 乙酸 95%乙醇 无水乙醚 10%硫酸 氨水 5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 苔黑酚-三氯化铁溶液：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.6H2O。临用时配制。,四、实验步骤,1.RNA的提取：称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液20ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟（4000r.p.m）。 取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。 滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。 洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。,2.鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸12分钟，将RNA水解。 取水解液0.5ml，加入苔黑酚-三氯化铁溶液1ml，加热至沸1分钟，观察颜色变 化。 水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。,实验十一 DNA的定量测定-二苯胺法,一、原理 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。,二、实验仪器 试管 移液管 7220分光光度计,三、实验试剂,1、DNA标准液（100ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。 2、二苯胺试剂： A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。 B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制 临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可,四、试验步骤 1.标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：,加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。,2.样品测定 吸取DNA样液1ml，加入二苯胺溶液2.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。 五、结果计算 按下式计算样品中DNA百分含量： DNA%=样液中测的DNA量/样液中所含样品量*100%,实验十二 维生素C的定量测定（2，6-二氯靛酚滴定法）,一、原理 维生素c又称为抗坏血酸，其还原型能还原染料2，6-二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。 在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成红色，被还原后变为无色。 因此可用2，6-二氯靛酚滴定样品中含有的维生素C，当样品中的维生素C被完全还原后，在滴加过量的2，6-二氯靛酚，溶液变为淡红色，即为终点。 如无其他杂质干扰，则样品液所还原的2，6-二氯靛酚的量与样品中所含有维生素C的量成正比。,二、实验仪器 新鲜水果 吸管 容量瓶 滴定装置 锥形瓶 研钵 漏斗,三、实验试剂 1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。 2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸馏水。 3、标准维生素C液：准确称取10.0mg维生素C，溶于1%草酸溶液，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配制。此溶