[中医中药]中药保肝作用及机理研究的思路与方法.ppt

中药保肝作用及机理研究 的思路与方法,南通市第三人民医院 窦志华 2011-11-19,药效物质基础及作用机理是中药及中药复方研究的核心，也是中药现代化的关键。但由于中药化学成分的复杂性，以及有效成分对机体作用的协同性，研究十分困难，目前还没有一种理想的研究方法，已成为制约中医药现代化发展公认的瓶颈问题。寻找适于中药复杂体系的研究方法，阐明中药药效物质基础及作用机理，一直是中药研究的关键科学问题，已列入国家中长期科学和技术发展规划纲要、“重大新药创制”科技重大专项和中医药创新发展规划纲要相关领域和主题的重要内容。,中药药效物质基础及作用机理研究的意义,对于中药药效物质基础有多种提法，如： 有效部位群 活性物质群 功能组分集 有效成分组 有效组合成分（部位） 有效部分 有效系统,对中药药效物质基础的认识,实质都是有效成分的组合，即中药发挥疗效的不是单个或几个有效成分，而是多种成分，这些成分可能属于不同的化学类型，也可以是不同的作用机制物质，通过不同途径实现协同作用，达到治疗疾病的目的。有效成分组更能反映中药有效成分存在的状况。,所谓有效成分组，是指中药所含有的所有与临床应用目的密切相关的药理活性成分。有效成分组不是中药的有效部位，也不是有效组分，更不是独立的有效成分。有效部位、有效组分或有效成分，通常是指独立的一部分，这些成分并不能代表中药的全部药理作用，中药发挥作用的成分往往存在于多个部位或多个组分中，而且同一个部位或组分中可能也含有非有效成分，因此，有效成分组是指复方中含有的全部有效成分，而不考虑所分布的部位。,对中药药效物质基础的认识,中药药效物质基础的研究，应涉及制剂制备过程、消化道运行过程、菌丛对化学物质的影响、体内转运代谢，从而阐明有效成分的生成、吸收、分布、代谢的全过程。,对中药药效物质基础的认识,简 化 处 理,相关性分析,三个化学层次 成分分析,药理试验 四个药理水平,一个结合,研 究 结 果,两个基本说清,中药及复方,还原性验证,讲清复方中有效的化学成分；讲清复方中有效化学成分所起的治疗作用,药物 有效部分 化学成分,整体动物实验 组织器官 细胞亚细胞 分子生物学,中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法,中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法,生物色谱是将活性生物大分子（酶、受体、传输蛋白等）、活性细胞膜、甚至活细胞等固着于色谱担体上作为固定相的一种新兴色谱技术。这种色谱系统能够模仿药物与生物大分子、靶体或细胞之间的特异性、立体选择性相互作用，可以排除大量非作用杂质成分的干扰，为中药有效成分的筛选及作用机制的阐明提供了全新的思路和方法。根据作为固定相的生物活性物质的不同，生物色谱法又分为分子生物色谱法、生物膜色谱法（或仿生物膜色谱法）、细胞生物色谱法等。另外还建立了细胞膜特异性结合中药提取液中成分并加以分析的细胞膜固相色谱。,中药药效物质基础及作用机理研究思路与方法,中药保肝作用及机理研究的思路与方法,中药保肝作用及机理研究的思路与方法,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,单味中药的药效物质基础研究较中药复方要相对容易，可以按照前面讲到从三个化学层次，四个药里水平，采用化学分离和药效跟踪相结合的方法对中药药效物质基础进行研究。下面以“赤芍保肝退黄药效物质基础研究”为例对这一方法进行探讨。,赤芍中的化学成分以单萜及其苷类为主，总称赤芍总苷，其中芍药苷、芍药内酯苷含量较高。此外，还含有丹皮酚、三萜类、酚及其苷类、甾醇及其苷类、鞣质、黄酮类、挥发油等。,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,总体方案设计图,活性组分筛选 3个组分药效试验比较,试验用药制备,赤芍饮片,70乙醇回流提取,回流液,水提部位,回收乙醇并浓缩,干燥后加水煎煮并浓缩,药渣,醇提部位,HPLC测定两部位中芍药苷、芍药内酯苷含量,一、赤芍保肝退黄活性部位初步筛选 醇提部位与水提部位药效试验比较,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,生理盐水灌胃,CCL4造模,CCL4造模，药物干预,观察指标,血清学指标：总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)、丙 氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP) 。 肝组织病理变化半定量分析,统计学处理,数据以xs表示，使用wstata7.0统计软件包进行单因素方差分析，组间比较采用Scheffe法检验，以P0.05为显著性判断界值。,c,c,b,a,a,a,c,aP0.01 vs normal group；bP0.01，cP0.05 vs model group（以下所有柱形图均同）,小鼠血清TBIL、DBIL及TBA测定结果（ xs，n=10）,结果,c,b,b,a,a,a,b,c,b,c,b,小鼠血清ALT、AST及ALP测定结果（ xs，n=10）,醇提部位和水提部位对胆汁淤积肝损伤小鼠肝组织的影响 （HE300倍）,A-正常对照组 B-模型对照组 C-醇提部位中剂量组 D-水提部位中剂量组,以上研究结果提示：赤芍提取物具有一定的保肝退黄作用，其主要药效物质主要存在于醇提部位。,本部分首先建立了HPLC法同时测定赤芍中芍药苷、芍药内酯苷的方法，并对赤芍饮片及醇提部位和水提部位进行了相关成分的含量测定，结果表明，芍药苷、芍药内酯苷等单萜苷类化合物基本转移至醇提部位，与药效试验结果有一定相关性，提示该类成分有可能为赤芍保肝退黄的活性成分。为进一步跟踪研究活性成分，本章随后采用D101型大孔树脂考察了从醇提浸膏中纯化赤芍总苷的技术参数，并将醇提部位进一步分离为加水溶解后的沉淀部分、赤芍总苷及其余部分，为下一步继续跟踪有效组分提供了实验材料。,二、赤芍活性部位成分分析及组分分离,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,1、含量测定方法的建立及赤芍饮片、醇提部位和水提部位的含量测定,a-albiflorin；b-paeoniflorin 对照品（A）、赤芍饮片（B）、醇提部位（C）和水提部位（D）HPLC色谱图,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,上柱样品液的制备,2、大孔树脂从醇提部位赤芍总苷分离,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,芍药内酯苷、芍药苷吸附曲线,动态吸附曲线考察,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,8倍量20%乙醇洗脱后，洗脱液中芍药内酯苷、芍药苷不再明显减少，故确定洗脱剂用量为8倍树脂体积。（13流份为水洗液）,芍药内酯苷、芍药苷洗脱曲线,洗脱曲线考察,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,芍药内酯苷、芍药苷的洗脱率,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,小试结果,3、醇提部位3个组分分离及相关成分的含量测定,三、醇提部位活性组分筛选,a,b,a,c,b,b,b,b,b,b,b,b,a,b,b,b,b,b,小鼠血清TBIL、DBIL及TBA测定结果（ xs，n=10）,a,b,a,c,b,b,c,b,b,b,b,a,b,b,b,b,b,b,小鼠血清ALT、AST及ALP测定结果（ xs，n=10）,赤芍醇提浸膏中不同部位对胆汁淤积肝损伤小鼠肝组织的影响（HE300倍）,C,A,B,a,b,b,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,四、活性组分及其主要成分作用机理研究及药效验证,基于成分分离的中药保肝作用及机理研究,1、赤芍总苷对小鼠胆汁分泌、戊巴比妥钠睡眠时间及UDPG-T活性的影响（略） 2、芍药苷的保肝退黄作用评价（略）,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,含药血清，是指给动物或人服用药物后一定时间采血、分离的血清，该血清中含有原形药物成分及其代谢产物，我们将其统称为“血中药源性成分”。 血清药理学，指将含药血清作用于体外细胞模型进行药效评价。 血清药化学，指通过指纹图谱及现代分析方法对含药血清中的药源性成分进行定性定量分析。,疗效确切 组方简单,单味药成分研究较深入 有客观、灵敏的药效价评价指标,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,以复方五仁醇胶囊为对象的相关研究,含药血清,定性定量分析,肝细胞 损伤模型,保肝药理试验,谱 效 关 系 分 析,药 效 物 质 基 础,体 外 化 合 物,结果验证,技术路线图,体外制剂成分分析 血清药理学研究 血清药化学研究 谱效结合分析药效物质基础及结果验证,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,1、体外制剂HPLC指纹图谱研究,一、体外制剂成分分析,五味子醇甲,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,10批制剂指纹图谱重叠图,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,A、全方制剂 B、单味五味子制剂 C、五味子阴性制剂,原料药材与制剂指纹图谱相关性分析,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,原料药材与制剂指纹图谱相关性分析,A、全方制剂 B、单味三七制剂 C、三七阴性制剂,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,原料药材与制剂指纹图谱相关性分析,A、全方制剂 B、单味柴胡制剂 C、柴胡阴性制剂,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,原料药材与制剂指纹图谱相关性分析,A、全方制剂 B、单味叶下珠制剂 C、叶下珠阴性制剂,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,ELSD,UV at 210nm,HPLC-DAD/ELSD 检测结果,a. 三七皂苷R1 b. 人参皂苷Rg1 c.人参皂苷Rb1 d. 柴胡皂苷a e. 柴胡皂苷d,指纹图谱部分共有峰的鉴别 (HPLC-DAD 210nm),a.三七皂苷R1 b.人参皂苷Rg1 c.人参皂苷Rb1 d.五味子醇甲 e.五味子醇乙 f.五味子酯甲 g.五味子甲素 h.五味子乙素,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,共有峰与相应对照品峰紫外光谱图比较,Peak 7: gomisin J Peak 23: gomisin N Peak 26: schisandrin C,?,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,a,c,d,e,b,a. 五味子醇甲 b. 五味子醇乙 c. 五味子酯甲 d. 五味子甲素 e. 五味子乙素,总离子流图（TIC） A：对照品 B：体外制剂,木 脂 素 类 成 分,2、体外制剂UPLC-MS/MS检测,提取离子流图（EIC）：五味子醇甲（m/z:433）,质谱图：五味子醇甲,制剂中木脂素类成分UPLC-MS/MS检测结果,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,a,c,d,e,b,a.三七皂苷R1 b.人参皂苷Rg1 c.人参皂苷Rb1 d.柴胡皂苷a e.柴胡皂苷d,总离子流图（TIC） A：对照品 B：体外制剂,皂 苷 类 成 分,三七皂苷R1 (m/z:955),glc, glc(21)xyl,皂苷类成分UPLC-MS/MS检测结果,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,血清供体：正常SD大鼠 给药方案：每天间隔8h灌胃2次，连续3d 采血时间：末次给药后1h,二、血清药理学研究,1、含药血清制备方法:给药形式及剂量考察,cd,cd,ad,ad,ab,ab,a,ac,ac,ac,ac,c,1、制剂原形组 2、提取物低剂量组 3、提取物中剂量组 4、提取物高剂量组,aP0.01, vs normal bP0.05, cP0.01, vs model dP0.05, vs group 3,肝细胞增殖,ALT泄漏,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,因素水平表,2、含药血清制备方法:其他因素正交试验优选,加权评分：MTT 35%ALT 35Sch 30,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,L8(27)正交设计及试验结果,方差分析结果,B、C因素交互作用分析,A1B1C1D1,1、5%含药血清组 2、10%含药血清组 3、20%含药血清组 4、40%含药血清组,aP0.01, vs normal bP0.05, cP0.01, vs model dP0.05, eP0.01, vs 2,ce,ce,ae,ae,ac,ac,ac,acd,acd,abe,ace,ace,3、血清添加量考察,MDA含量及SOD活性测定结果 (n=6),aP0.05, bP0.01, vs normal; cP0.01,vs model,4、含药血清的抗氧化作用及对肝细胞凋亡的影响,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,细胞核DAPI染色 荧光显微镜观察结果,正常组,模型组,含药血清组,透射电镜观察肝细胞超微结构,正常组肝细胞,正常组线粒体,模型组,含药血清组,Annexin -FITC/PI双染色流式细胞仪定量检测细胞凋亡,normal,model,serum contain CWC,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,aP0.01, vs normal; bP0.05, cP0.01, vs model,细胞凋亡定量检测结果,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,血中移行成分,血中药源性成分,三、血清药化学研究,1、含药血清HPLC指纹图谱研究,A：参照物 B：含药血清 C：空白血清,10批含药血清指纹图谱重叠图,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,10批含药血清指纹图谱技术参数,相似度计算结果,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,体外制剂(A)、含药血清(B)及对照品(C) 色谱图(HPLC- DAD 210mn),a. 五味子醇甲 b. 五味子醇乙 c. 五味子酯甲 d. 五味子甲素 e. 五味子乙素,7.戈米辛J 23.戈米辛N 26.五味子丙素,光谱图 A：体外制剂 B：含药血清 C：对照品,联苯环辛烯类木脂素的结构式及其光谱图,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,2、含药血清UPLC-MS/MS检测,b,c,d,e,a,木脂素类成分,a. 五味子醇甲 b. 五味子醇乙 c. 五味子酯甲 d. 五味子甲素 e. 五味子乙素,总离子流图（TIC） A：对照品 B：含药血清 C：空白血清,提取离子流图（EIC）：五味子醇甲（m/z:433）,质谱图：五味子醇甲,戈米辛J（m/z:389）,五味子丙素（m/z:385）,含药血清中木脂素类成分UPLC-MS/MS检测结果,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,皂苷类成分,e,c,d,a b,a. 三七皂苷R1 b. 人参皂苷Rg1 c.人参皂苷Rb1 d. 柴胡皂苷a e. 柴胡皂苷d,总离子流图（TIC） A：对照品 B：含药血清 C：空白血清,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,glc(61)glc,glc(21)glc,人参皂苷Rb1 (m/z:1131),Assaying of 4 lignans in serum containing CWC,3、含药血清中木脂素类成分含量测定,a. 五味子醇甲 b. 五味子醇乙 c. 五味子甲素 d. 五味子乙素,含药血清（A）、对照品（B）及空白血清（C）色谱图,5批含药血清含量测定结果,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,四、谱效结合分析药效物质基础及结果验证,1、含药血清的谱效学研究药效物质基础分析,A：单味五味子制剂含药血清 B：五味子阴性制剂含药血清 C：全方制剂含药血清 D：空白血清,A：单味三七制剂含药血清 B：三七阴性制剂含药血清 C：全方制剂含药血清 D：空白血清,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,A：单味柴胡制剂含药血清 B：柴胡阴性制剂含药血清 C：全方制剂含药血清 D：空白血清,基于血清药理学与血清药化学相结合的中药复方保肝作用及机理研究思路与方法,A：单味叶下珠制剂含药血清 B：叶下珠阴性制剂含药血清 C：全方制剂含药血清