环境生物学实验指导书.doc

实验一 环境中有机物辛醇水分配系数的测定（4学时）一、实验目的1掌握有机物再不同相中分配系数的测定方法。2学会使用分光光度计。二、实验原理环境中各种有机污染物，在不同环境条件下的分配系数是不同的，有机物在土壤中被吸附，经日光照射、雨水冲刷，可能进行转化和迁移，特别是有机物在生物体中可以被浓缩，进入食物链，因此，我们测定有机化合物在不同环境中的分配系数，对评价有机物在环境中的浓度比，以P表示： P Dc / Da式中：Dc非水相的平衡浓度； Da水相中有机物的平衡浓度。为了比较化合物在生物体重的富集情况，一般选用辛醇（nOctanol）为非水相，得到正辛醇水分配系数Pow。由于辛醇中有机物的浓度难以测定，我们只选择水中有机物的浓度，根据测定的水相中分配前后有机物的浓度差，确定样品在有机相中的分配后的浓度，求得分配系数的计算公式： Pow（ CoVoCwVw）/ （CwVw）式中：Co有机相初始浓度； Cw分配平衡后水相浓度； Vo、Vw分别为有机相和水相的体积。三、仪器和试剂1仪器：7530分光光度计一台、振荡机一台、离心机一台、25 mL容量瓶1个、塑料瓶8个、10 mL离心管8个、1 mL移液管8个、2mL一个、5 mL一个、10 mL一个、滴管一个。2试剂：正辛醇、乙醇（95）、对二甲苯（已配）、苯胺（已配）。四、实验步骤（一）标准曲线的制作 由100g/mL标准溶液（对二甲苯）分别取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，在7530分光光度计上测定（波长为227 nm）。 取苯胺标准溶液（100g/mL）1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，在751分光光度计上测定（波长为279 nm）。（二）分配系数的测定 分别取已配制的苯胺辛醇、对二甲苯辛醇液1.0mL加入塑料瓶中，再加入9.0mL水，盖好，振荡3h。每个样品取三个平行样，并作空白样振荡后的样品，转移到离心管中，离心分离，用滴管吸去有机相，重复离心一次，其水样分别再227nm和279nm测定两种样品的浓度。五、结果与讨论1测得的结果再标准曲线上查得浓度制表。2由公式计算其分配系数。3根据两种样品的结果进行必要的讨论。实验二 水体中溶解氧及其饱和度的测定（碘量法）（2学时）一、实验目的1、掌握水样溶解氧的测定方法2、了解溶解氧饱和度的效应及意义二、方法原理 水样中加入硫酸锰和碱性碘化钾，水中溶解氧将低价锰氧化成高价锰，生成四价锰的氢氧化物棕色沉淀。加酸后，氢氧化物沉淀溶解并与碘离子反应释放出游离碘，以淀粉做指示剂，用硫代硫酸钠滴定释放出的碘，可计算溶解氧的含量。三、仪器与试剂250300 ml溶解氧瓶，硫酸锰溶液，碱性碘化钾溶液，（1+5）硫酸溶液，1%淀粉溶液，0.025 mol/L重铬酸钾标准溶液（用于标定硫代硫酸钠溶液），硫代硫酸钠溶液。硫代硫酸钠溶液的标定：于250 ml碘量瓶中，加入100 ml水和1 g碘化钾，加入10.00 ml 0.025 mol/L标准溶液和5 ml (1+5)硫酸溶液，密塞，摇匀。于暗处静置5 min后，用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入1ml淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪去为止，记录用量。 式中：M硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L）； V滴定时消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）。四、实验步骤1、采样：用水样冲洗溶解氧瓶后，沿瓶壁直接倾注水样或用虹吸法将吸管插入溶解氧瓶底部，注入水样至溢流出瓶容积的1/31/2。采样时不使水样曝气或有气泡残存在溶解氧瓶中，并存于冷暗处。2、溶解氧的固定：用吸管插入溶解氧瓶的液面以下，加入1 ml硫酸锰溶液、2 ml 碱性碘化钾溶液，盖好瓶塞，颠倒混合数次，静置。待棕色沉淀物降至瓶内一半时，再颠倒混合一次，待沉淀物下降到瓶底。一般在取样现场固定。3、析出碘：轻轻打开瓶塞，立即用吸管插入液面下加入5.0 ml硫酸，小心盖好瓶塞，颠倒混合摇匀至沉淀物全部溶解为止，放置暗处5 min。4、滴定：移取100.0 ml上述溶液于250 ml锥形瓶中，用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入1ml淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪去为止，记录硫代硫酸钠溶液用量。5、.计算式中：M硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L）； V滴定时消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）。五、结果与讨论1、分析该水体的溶解氧饱和度2、评价该水体水质六、注意事项 如果水样呈强酸性或强碱性，可用氢氧化钠或硫酸溶液调至中性后测定。实验三 富营养化水体中叶绿素a的测定（2学时）一、实验目的1、掌握水样叶绿色a的测定方法2、了解叶绿素a对水体富营养化评价的意义二、实验原理：许多参数可用作水体富营养化的指标，常用的是总磷、叶绿素-a含量和初级生产率的大小（见表7-1）。 测定水体中的叶绿素-a的含量，可估计该水体的绿色植物存在量。将色素用丙酮萃取，测量其吸光度值，便可以测得叶绿素- a的含量。三、实验材料：1. 仪器 (1) 可见分光光度计。 (2) 移液管：1 mL、2 mL、10 mL。 (3) 容量瓶：100 mL、250 mL。 (4) 锥型瓶：250 mL。 (5) 比色管：25 mL。 (6) BOD瓶：250 mL。 (7) 具塞小试管：10 mL。 (8) 玻璃纤维滤膜、剪刀、玻棒、夹子。2. 试剂 (1) 过硫酸铵（固体）。 (2) 浓硫酸。 (3) 1 mol/L 硫酸溶液。 (4) 2 mol/L 盐酸溶液。 (5) 6 mol/L氢氧化钠溶液。 (6) 1%酚酞：1 g酚酞溶于90 mL乙醇中，加水至100 mL。 (7) 丙酮:水（9:1）溶液。 四、实验步骤：1、将100500 mL水样经玻璃纤维滤膜过滤，记录过滤水样的体积。将滤纸卷成香烟状，放入小瓶或离心管。加10 mL或足以使滤纸淹没的90%丙酮液，记录体积，塞住瓶塞，并在4下暗处放置4 h（若消解不彻底可水浴60度加热）。如有浑浊，可离心萃取。将一些萃取液倒入1 cm玻璃比色皿，加比色皿盖，以试剂空白为参比，分别在波长665 nm和750 nm处测其吸光度。、 2、加1滴2 mol/L盐酸于上述两只比色皿中，混匀并放置1 min，再在波长665 nm和750 nm处测定吸光度。 3、结果处理 酸化前 ： A=A665-A750酸化后： Aa=A665a-A750a在665 nm处测得吸光度减去750 nm处测得值是为了校正浑浊液。用下式计算叶绿素- a的浓度（g/L）： 根据测定结果，评价水体富营养化状况。 五、结果讨论被测水体的富营养化状况如何？六、注意事项1、比色皿用完后需要浸泡在丙酮溶液当中，以免纤维物质凝固后不易清洗。2、加热消解过程中，注意防止丙酮沸腾。实验四 富营养化水体中总磷的测定（2学时）一、实验目的1、掌握水样可溶性磷的测定方法2、理解可溶性磷作为水体富营养化指标的评价意义二、实验原理许多参数可用作水体富营养化的指标，常用的是总磷、叶绿素-a含量和初级生产率的大小（见表7-1）。 在酸性溶液中，将各种形态的磷转化成磷酸根离子(PO43- )。随之用钼酸铵和酒石酸锑钾与之反应，生成磷钼锑杂多酸，再用抗坏血酸把它还原为深色钼蓝。砷酸盐与磷酸盐一样也能生成钼蓝，0.1 g/mL的砷就会干扰测定。六价铬、二价铜和亚硝酸盐能氧化钼蓝，使测定结果偏低。三、实验仪器和试剂1. 仪器 (1) 可见分光光度计。 (2) 移液管：1 mL、2 mL、10 mL。 (3) 容量瓶：100 mL、250 mL。 (4) 锥型瓶：250 mL。 (5) 比色管：25 mL。 (6) BOD瓶：250 mL。 2. 试剂 (1) 酒石酸锑钾溶液：将4.4 g K(SbO)C4H4O61/2H2O溶于200 mL蒸馏水中，用棕色瓶在4时保存。 (2) 钼酸铵溶液：将20 g (NH4)6MO7O244H2O溶于500 mL蒸馏水中，用塑料瓶在4时保存。 (3) 抗坏血酸溶液：0.1 mol/L（溶解1.76 g抗坏血酸于100 mL蒸馏水中，转入棕色瓶，若在在4时保存，可维持一个星期不变）。(4)混合试剂：50 mL 2 mol/L硫酸、5 mL酒石酸锑钾溶液、15 mL钼酸铵溶液和30 mL抗坏血酸溶液。混合前，先让上述溶液达到室温，并按上述次序混合。在加入酒石酸锑钾或钼酸铵后，如混合试剂有浑浊，须摇动混合试剂，并放置几分钟，至澄清为止。若在4下保存，可维持1个星期不变。 (5) 磷酸盐储备液（1.00 mg/mL磷）：称取1.098 g KH2PO4，溶解后转入250 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得1.00 mg/mL磷溶液。 (6) 磷酸盐标准溶液：量取1.00 mL储备液于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得磷含量为10 g / mL的工作液。四、实验步骤：1、水样处理：水样中如有大的微粒，可用搅拌器搅拌23 min，以至混合均匀。量取100 mL水样（或经稀释的水样）2份，分别放入250 mL锥型瓶中，另取100 mL蒸馏水于250 mL锥型瓶中作为对照，分别加入1 mL 2 mol/L H2SO4，3 g (NH4)2S2O8，微沸约1 h，补加蒸馏水使体积为2550 mL（如锥型瓶壁上有白色凝聚物，应用蒸馏水将其冲入溶液中），再加热数分钟。冷却后，加一滴酚酞，并用6 mol/L NaOH将溶液中和至微红色。再滴加2 mol/L HCl使粉红色恰好褪去，转入100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，移取25 mL至50 mL比色管中，加1 mL混合试剂，摇匀后，放置10 min，加水稀释至刻度再摇匀，放置10 min，以试剂空白作参比，用1cm比色皿， 于波长880 nm处测定吸光度（若分光光度计不能测定880 nm处的吸光度，可选择710 nm波长）。 2、标准曲线的绘制：分别吸取10 g / mL磷的标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于50 mL比色管中，加水稀释至约25 mL，加入1 mL混合试剂，摇匀后放置10 min，加水稀释至刻度，再摇匀，10 min后，以试剂空白作参比，用1 cm比色皿， 于波长880 nm处测定吸光度。3、结果处理由标准曲线查得磷的含量，按下式计算水中磷的含量： 式中，P为水中磷的含量，g/L；Pi为由标准曲线上查得磷含量，g；V为测定时吸取水样的体积（本实验V=25.00mL）。五、结果与讨论1.水体中氮、磷的主要来源有哪些？ 2.被测水体的富营养化状况如何？实验五 水稻种子在不同浓度铅溶液中萌发率的变化（2学时）一、实验目的1、理解铅污染对水稻种子萌芽率的影响2、掌握分析重金属污染效应的基本方法二、实验原理用不同浓度醋酸铅溶液培养水稻种子，研究铅对水稻种子萌发的影响，了解和掌握以水稻代表的发芽势和发芽率进行的毒性实验的具体方法及毒物对水稻发芽势与发芽率的影响；通过水稻种子发芽毒性试验，了解铅对水稻种子的毒性效应，监测水体污染程度以及评价水体的使用价值，为早期预报重金属对植物的毒害，为环境监测中评价重金属污染程度提供理论依据。三、仪器和试剂1、材料和器材水稻种子；分析纯醋酸铅；蒸馏水；培养皿；滤纸；尺子；恒温光照培养皿，温度设定为25。2、方法在一定温度、湿度和光照条件下，用滤纸做发芽床，分别在第3天和第7天测定发芽势和发芽率。四、实验步骤1、挑选籽粒饱满、大小一致的水稻种子300粒，随机分成6组，每组50粒。取6只培养皿，铺上2层滤纸，分别编号为1、2、3、4、5、6。2、用蒸馏水将醋酸铅溶液逐级稀释为40mg/l、80 mg /l、100 mg /l、200 mg /l、400 mg /l，稀释过程中pH值的变化可不作考虑，获得5种不同浓度的污染液。3、向1、2、3、4、5号培养皿加入5ml的不同浓度醋酸铅污染液（浸湿滤纸即可），6号培养皿加入等体积的蒸馏水作为对照。作3次重复。4、在每只培养皿的滤纸上，均匀放置50粒水稻种子。 5、将6只培养皿置于25、相对湿度75%、光照条件下的恒温培养箱中培养；每天各实验组、对照组补充适量蒸馏水，以保持滤纸的湿润。6、发芽势与发芽率的计算，分别与第3天和第7天测定记录水稻种子发芽情况，将感染霉菌的种子要及时除去。发芽势（%）=规定天数内已发芽的种子粒数/供作发芽的种子总粒数100发芽率(%) =全部发芽的种子粒数/供作发芽的种子总粒数100%7、种子发芽后应具备的特征：水稻在正常发育的幼根中，其主根长度不短于种子长度，幼芽长度不短于种子长度的1/2者，为具有发芽能力的种子，以此标准进行观察、计数 五、结果与讨论1、结果报告：种子名称，来源，每种浓度处理的种子数，培养条件，污染物的每种浓度处理组和对照组的发芽率和发芽势的平均值。2、本实验结果说明了什么？是否还需要进一步做实验证实？3、影响水稻发芽的主要因素是什么？试从植物种子发芽生理角度做分析。试验六 二氧化硫对植物叶片的熏气实验及其观察（4学时）一、实验目的1、了解二氧化硫污染对植物叶片伤害的过程2、掌握分析大气污染效应的基本方法二、实验原理：二氧化硫可以破坏植物叶片的蜡质层和叶片中的叶绿素，导致叶片失绿、褐斑等一系列伤害，本实验中定量的亚硫酸钠和过量的稀硫酸可以产生一定量的二氧化硫气体，在半封闭环境中可以维持一定浓度，模拟二氧化硫对植物叶片的影响并观察，可以观察植物叶片在一定二氧化硫浓度下的表现。三、仪器和试剂蚕豆幼苗，稀硫酸，亚硫酸钠，烧杯（1000 ml和50 ml）四、实验步骤：选择高度适合，叶片较为舒展以及具有成熟叶、老叶和新叶的蚕豆幼苗放入一次性塑料杯中，加入20 ml水，浸没蚕豆幼苗根部为准。分别称取亚硫酸钠0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0，并分别倒入装有20 ml稀硫酸的小烧杯中。迅速将1000 ml大烧杯倒置盖住塑料杯和小烧杯，并用棉花团塞住烧杯弯嘴部分。（附记录表）时间0.00.10.20.51.02.05.0老叶成叶新叶老叶成叶新叶老叶成叶新叶老叶成叶新叶老叶成叶新叶老叶成叶新叶老叶成叶新叶5m10m20m30m45m1h12h24h48h五、注意事项：1、考虑到向阳和通风，选择在窗户边进行实验2、加入亚硫酸钠后迅速盖住小烧杯3、对样品严格进行标号，注明组别、浓度以及时间实验七 苯对小白鼠的急性毒性实验（4学时）一、实验目的1、了解有毒有机大气污染物对生物体的伤害2、掌握一般急性毒性实验的基本方法，半数致死剂量的计算3、了解一般熏气实验的过程二、实验原理在空气中不同苯浓度情况下，小白鼠因为吸入苯影响到神经系统和血液循环系统往往产生厌恶、行为不协调、抽搐甚至死亡。不同浓度下的苯影响不一，而随着毒物作用时间的延长，小白鼠的毒性反应也会呈现加重趋势。用半封闭熏气法测定苯对小白鼠的急性毒性实验，得到小白鼠在苯存在情况下的毒性反应和半数致死浓度。以及不同时间的毒性反应。三、实验仪器和试剂500 ml锥形瓶12支，1000 ml烧杯12支，小白鼠100只，橡皮筋若干，滤纸若干。三、实验步骤1、取500ml锥形瓶6只，分别装入雄鼠6只（按照头、右前肢、右后肢、尾、左后肢、左前肢编号），另取锥形瓶6只，分别装入雌鼠6只（编号同上）。2、锥形瓶用纱布包裹瓶口，用橡皮筋捆住纱布边沿。3、用细线捆绑一团滤纸，加入0.0，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 ml苯，放入锥形瓶，线端用橡皮筋与纱布一起捆绑。4、外面加罩1000 ml烧杯，24 h后加同等剂量苯。5、观察并记录小鼠反应及表现（行动加速、紧张、烦躁、呼吸变化、卧躺姿势、抽搐、死亡以及其他异常表现，其中死亡定义为触碰无反应），每个锥形瓶中的小鼠反应注明编号。四、结果与讨论填写记录表并汇总，计算一日、二日、三日半数致死浓度。五、注意事项1、小鼠牙齿锋利，谨防被咬伤划伤2、苯的采取和放置要迅速准确，减少挥发实验八 锌对鲫鱼幼苗的急性毒性及安全浓度评价（6学时）一、实验目的1、了解重金属对水体鱼类的毒性2、掌握静水生物测试法的基本方法3、掌握半数致死剂量和安全质量浓度的评价二、实验原理对绝大多数被试验过的有毒化学物质来说，由早期生活阶段试验求得的最大允许毒物浓度(MATC)与慢性试验的结果相等或相接近，鱼类的胚胎和幼鱼阶段对重金属的污染最为敏感。利用静水生物测试法，从半数致死剂量、安全质量浓度等方面研究了锌污染对幼鲫鱼的急性毒性。三、实验材料3.1 试验动物鲫鱼幼苗（湖北省孝感市孝南区水产科研所提供），体长为（20.2）cm，0.350.40g/条，实验前1d停止投饵，选择身体健康，反应灵敏，大小基本一致的幼鱼200条左右，其中预实验25条，将鲫鱼放置于水族箱中，用增氧仪充氧 。3.2 试验药剂称取1g Cd粉（优级纯，纯度为99.96，天津市化学药剂厂）配制成质量浓度为1g/L的母液备用。3.3 试验条件15L的聚乙烯塑料桶1