重组长效GLP-1受体激动剂E4-Fc融合蛋白项目建议书.doc

重组长效GLP-1受体激动剂E4-Fc融合蛋白(rE4-Fc)项目建议书Tel：152083791162014年6月目 录概 要3一 项目介绍4（一） 适应症4（二）、作用机理5（三）、国内外进展6（四）、项目技术创新7（五）、市场需求7（六）、工艺情况8（七）、知识产权情况9二、项目风险分析10三、市场分析11四、投资及财务分析12五、合作方式12概 要 项目概述胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4（简称E4）分离自希拉毒蜥唾液,是由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽，结构上有53%氨基酸序列与哺乳动物胰高血糖素样肽-1受体（glucagon-like-peptide GLP-1）氨基酸序列相同，但不是GLP-1的类似物，其对人体胰岛细胞胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体具有极高的亲和力，通过与该受体的特异性结合，产生受体激动作用，在动物和人体内产生与GLP-1相似的生物学活性。主要用于改善型糖尿病患者血糖的控制，特别针对使用二甲双胍、磺脲类药物等合用口服降糖药物仍然不能有效控制血糖的型糖尿病患者，克服了现有糖尿病治疗药物的缺点。国内外进展目前，已经上市的该类产品为美国Eli Lilly公司和Amylin制药公司合作开发化学合成的exenatide，FDA于2005年批准其上市，2009年进入中国市场。AstraZeneca研制开发的长效制剂Bydureon于2012年获FDA批准。2014年AstraZeneca改进了给药方式的Bydureon Pen也获得FDA的批准，但还没有进入中国市场。目前，国内没有国产的长效艾塞那肽相关制剂上市。2009年，丹麦诺和诺德生产的GPL-1类似物利拉鲁肽被批准在欧洲上市，次年在美国上市，2011年正式进入中国市场，利拉鲁肽是在GLP-1上连接了一个脂肪酸侧链，增加了半衰期。Lilly公司正在开发长效的GLP-1-Fc（Dulaglutide）已完成期临床试验，正在申请FDA的批准。GSK公司研制的GLP-1与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白Albiglutide已经获得批准上市。市场分析据统计，2011年，全球糖尿病药物的销售总额高达260亿美元，据国外分析家最新的报告显示，进入21世纪，世界糖尿病用药市场总值将达357亿美元。中国目前每年大约花费120-130亿元人民币，预计到2025年，我国糖尿病治疗的费用将达到630亿人民币。根据国家卫生统计资料统计，1979年我国成人的糖尿病患病率不足1%， 2000年已达25003000万人，2012年我国糖尿病发病人数已达到9200万人。但令人忧虑的是，糖尿病不再只是中老年人病，有向青少年扩大的趋势。因此，开发针对型糖尿病具有良好治疗效果的药物具有广阔的市场前景。合作方式技术转让或合作开发一、项目介绍目前在中国已大约有5000万糖尿病患者，并以每年150-200万人增长，并呈现患者人群年轻化趋势。糖尿病确证患者中90%以上属于型糖尿病患者。其发病机理主要是胰岛素-细胞功能的渐进性衰竭，最后导致胰岛素分泌的不足。胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4(简称E4）分离自南非大毒蜥唾液,是由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽，结构上有53%氨基酸序列与哺乳动物胰高血糖素样肽-1受体（glucagon-like-peptide GLP-1）氨基酸序列相同，其对人体胰岛细胞胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体具有极高的亲和力，通过与该受体的特异性结合，产生受体激动作用，在动物和人体内产生与GLP-1相似的生物学活性，但生物学活性为GLP-1的1000倍。本项目利用创新技术和手段，率先采用以哺乳动物细胞CHO细胞为载体的基因重组技术生产制备重组长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂融合蛋白（即rE4-Fc），主要用于控制型糖尿病患者血糖，特别针对使用二甲双胍、磺脲类药物等合用口服降糖药物仍然不能有效控制血糖的型糖尿病患者，克服了现有糖尿病治疗药物的缺点。人IgGFc为抗体重链的铰链区（Hinge）和补体结合区（CH2、CH3），在重组药品的开发中，通常将其与目的蛋白融合以增加目的蛋白的半衰期。本项目采用CHO表达的重组长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂rE4-Fc融合蛋白与艾塞那肽相比，具有分子量大，体内半衰期长，患者对药物的依从性好，不需要像艾塞那肽那样每天注射两次，更是显著降低药物的免疫原性。（一） 适应症目前常用胰岛素、磺酰脲类和二甲双胍类等药物对患者血糖控制情况并不理想，用药患者的糖化血红蛋白（Hbalc）的平均值都8%，从而增加糖尿病患者发生肾病、致盲和心脏病等并发症的危险；且伴有体重增加、低血糖症、水肿等副作用。重组长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂rE4-Fc融合蛋白主要用于型糖尿病的治疗，特别针对使用二甲双胍、磺脲类药物等合用口服降糖药物仍然不能有效控制血糖的型糖尿病患者。（二）、作用机理艾塞那肽(exenatide ，商品名Byetta)是首个通过美国食品药品监督管理局批准的GLP-1受体激动剂，能持续有效地控制型糖尿病患者的血糖，改善细胞功能，并减轻患者体重。1. 保护胰岛细胞功能研究显示，艾塞那肽可能通过降低内质网应激反应基因，如X-盒结合蛋白1、活性转绿因子(ATF)-4、ATF6及转录因子CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白的表达，促进细胞增殖与新生，减少细胞的凋亡，从而增加细胞的数量。艾塞那肽也可以防止氧化应激引起的细胞凋亡，同时可以降低糖原合成酶激酶-3(GSK-3)活性、c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化与caspase活性，恢复胰岛素mRNA在细胞中的表达及胰岛素的分泌。2. 改善胰岛素抵抗在骨骼肌和脂肪中，艾塞那肽能够通过激活磷脂酰肌醇3激酶途径，促进葡萄糖依赖的促胰岛素分泌，改善外周组织对胰岛素的敏感性。研究显示，艾塞那肽预防了肝脏氧化应激的发生，逆转了体内胰岛素信号缺陷，继而预防了肝脏胰岛素抵抗的发生。同时，抑制胰高血糖素的分泌，减慢胃排空运动，减少食物摄入，降低糖尿病患者体重。3. 促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌与合成艾塞那肽具有双向调节血糖浓度的作用，其促进胰岛素分泌的作用呈葡萄糖依赖性。血糖浓度高时刺激胰岛素分泌，血糖浓度低时不刺激胰岛素分泌，临床上有效防止低血糖发生，同时良好控制血糖浓度。在正常或低血糖水平下，艾塞那肽与细胞上的G蛋白偶联受体特异性结合后，仅引起钙离子少量内流和胰岛素微量释放；而血糖浓度高时，细胞内的ATP/ADP比值升高，ATP依赖的钾通道开发使细胞恢复极化延迟，艾塞那肽与其受体结合后可引起钙离子长时间的内流，并导致较多的胰岛素释放。艾塞那肽通过与GLP-1受体结合激活腺苷酸环化酶，导致胞内的cAMP增加和蛋白激酶A(PKA)激活，直接通过cAMP-PKA通路增加L-型电压门控钙离子通道的钙离子内流和内质网钙离子释放而活化钙调蛋白，最终是胰岛素出胞作用增强。研究也发现，艾塞那肽能通过激活钙离子-钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMKK/CaMKIV)级联反应刺激ATP结合盒转运体A1基因转录或调控葡萄糖转运蛋白2的基因转录，从而刺激胰岛素的分泌。（三）、国内外进展糖尿病治疗药物的研究是目前国际药物研究领域的热点，在最新生命科学研究的基础上，针对一些新的药物靶点，正进行大量的药物研究。目前在糖尿病的治疗中，主要根据糖尿病的不同阶段，采用抑制糖吸收、促进糖代谢的药物进行治疗，但是目前常用胰岛素、磺酰脲类和二甲双胍类等药物对患者血糖控制情况并不理想，用药患者的糖化血红蛋白（Hbalc）的平均值都8%，从而增加糖尿病患者发生肾病、致盲和心脏病等并发症的危险；且伴有体重增加、低血糖症、水肿等副作用。2005年，美国食品药品监督管理局批准Lilly公司开发化学合成的exenatide，商品名Byetta，通用名Exenatide Injection。2009年进入中国市场，中文商品名为百泌达，通用名为艾塞那肽注射液，它是国内已经上市的唯一的短效人胰高糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，用于改善型糖尿病患者的血糖控制。百泌达拥有10年以上的临床和实际使用经验，累计使用量每年超过百万患者，良好的疗效获得了国内外的一致认可。艾塞那肽长效制剂有AstraZeneca研制开发的Bydureon（exenatide，艾塞那肽长效缓释注射悬液），是用于型糖尿病治疗的首个也是唯一一种每周一次的药物，于2012年获FDA批准。2014年AstraZeneca改进了给药方式的Bydureon Pen也获得FDA的批准。目前，国内没有国产的长效艾塞那肽相关制剂上市，Bydureon Pen也没有进入中国市场。2009年，丹麦诺和诺德生产的利拉鲁肽被批准在欧洲上市，次年在美国上市，2011年正式进入中国市场，利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽-1（GLP-1）类似物，与人GLP-1具有97%的序列同源性，其特点将GLP-1第20位的赖氨酸换成谷氨酸，并在此谷氨酸残基处接上1分子十六脘酸：棕榈酰(软脂酰)，从而增加半衰期。目前，Lilly公司正在开发长效的GLP-1（Dulaglutide），其特点是将GLP-1通过linker与抗体的Fc融合，采用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达，现已完成期临床试验，正在申请FDA的批准。GSK公司研制的GLP-1与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白Albiglutide已经获得批准上市。国内外其他一些制药公司也在开发不同形式的长效GLP-1或者长效Exendin-4。（四）、项目技术创新本项目采用基因工程技术将编码胰高血糖素样肽-1受体激动剂艾塞那肽（Exendin-4）与人免疫球蛋白IgG4的Fc段基因进行融合，构建高效的哺乳动物细胞表达载体。将构建的表达载体转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，再通过甲氨蝶呤(MTX)筛选并扩增目的基因，从而建立可稳定表达rExendin4-Fc蛋白的工程细胞株。对CHO工程细胞的进行大规模培养，上游培养采用批次流加培养工艺，经Protein A亲和层析可以获得纯度超过98%的目的蛋白，经过进一步的精细纯化以及病毒去除步骤，建立了非常简单有效的纯化工艺。人IgGFc为抗体重链的铰链区（Hinge）和补体结合区（CH2、CH3），在重组药品的开发中，通常将其与目的蛋白融合以增加目的蛋白的半衰期。本项目采用CHO表达的重组长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂融合蛋白（即rE4-Fc）与艾塞那肽相比，具有分子量大，体内半衰期长，患者对药物的依从性好，不需要像艾塞那肽注射液那样每天注射两次，更是显著降低药物的免疫原性。目前，不管是Lilly公司与Amylin制药公司合作开发的Byetta还是AstraZeneca研制开发的Bydureon(或Bydureon Pen)均为化学合成产品，化学合成法成本高，产量低，不利于大规模生产。诺和诺德生产的利拉鲁肽为通过基因重组技术，利用酵母生产的人胰高糖素样肽-1（GLP-1）类似物。Lilly公司开发的长效GLP-1 为CHO表达产品。因此，开发重组长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂艾塞那肽融合蛋白（即rE4-Fc）完全是一个技术创新项目。（五）、市场需求根据国家卫生统计资料统计，1979年我国成人的糖尿病患病率不足1%， 2000年已达25003000万人，2012年我国糖尿病发病人数已超过9200万人，至少90%是型糖尿病。但令人忧虑的是，糖尿病不再只是中老年人病，有向青少年扩大的趋势。据统计，2011年，全球糖尿病药物的销售总额高达260亿美元，据国外分析家最新的报告显示，进入21世纪，世界糖尿病用药市场总值将达357亿美元。中国目前每年大约花费120-130亿元人民币，预计到2025年，我国糖尿病治疗的费用将达到630亿人民币。（六）工艺情况1、细胞培养工艺简介工艺：种子复苏目的：复苏种子细胞，调整好细胞状态，种子扩增备用操作：37水浴快速解冻，1000rpm离心，重悬细胞，方瓶培养工艺：种子扩增目的：种子细胞扩大培养，为生产细胞提供种子细胞操作：方瓶三角摇瓶种子细胞罐，逐级扩大培养工艺：生产细胞培养目的：培养细胞，收获细胞培养液操作：接种细胞到生产细胞罐，流加浓缩培养基和植物水解蛋白，37培养，收获培养液目前，该项目经过培基础养基筛选、流加组分筛选以及摇瓶培养工艺优化，5L生物反应器培养工艺的优化，已经初步形成了稳定的5L反应器培养工艺，已做的关键指标的检测所用样品均来自5L反应器的样品。2、主要技术特点与技术指标：1）技术特点本项目采用基因工程技术将编码胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4与人免疫球蛋白IgG4的Fc段基因进行融合，构建高效的哺乳动物细胞表达载体。Exendin-4只有39个氨基酸，分子量相对较小，单独表达的难度非常大，表达量低，采用融合方式表达在目前的5L反应器条件下可以达到500800mg/L，进一步优化培养工艺还有继续提升表达量的空间；融合IgG4的Fc有利于下游纯化，同时Fc也不会产生ADCC功能，培养上清经过Protein A纯化纯度就可达到98%，后续的纯化压力非常小；融合Fc表达显著增加药物蛋白在体内的半衰期，减轻了患者的痛苦，增加了依从性；Exendin-4基因与人的GLP-1基因只有53%的序列同源，在使用Byetta或Bydureon后不可避免的会产生抗体，融合Fc会显著降低蛋白药物的免疫原性。采用CHO表达E4-Fc融合蛋白培养工艺和纯化工艺相对简单，容易实现放大，Lilly公司GLP-1-Fc临床用量为1.6mg/次/周，以保守的表达量计算每1000L规模可以生产20万支，而1000L规模的培养直接成本不及50万人民币，从而大大提高产品得率，降低生产成本。2）技术指标(1).建立了稳定表达rE-4-Fc的CHO工程细胞株。(2).建立了的5L反应器培养工艺，表达量稳定在500800mg/L，进一步优化还有提升空间。(3).建立了体外生物学活性测定方法。3、现有工作基础(1) 已成功构建了rE4-Fc高效的真核表达质粒。(2) 经过细胞转染、筛选已经获得了稳定表达rE4-Fc的工程细胞株。(3) 经过摇瓶工艺条件的初步摸索，初步建立了7.5L生物反应器培养工艺，工程细胞株的目的蛋白表达水平至少可以达到500mg/L左右，如果进一步的工艺优化表达水平还能有较大提升的空间。(4) 体外生物学活性测定方法已建立，并对7.5L反应器制备的样品进行了测定，生物学活性非常明显。(5) 目的蛋白的DNA和氨基酸序列已经得到验证，与设计一致。4、预计完成工作(1) 项目启动后810个月完成质量研究和质量标准的建立，并制备足够的合格样品用于动物实验和稳定性考察试验；(2) 618个月完成药理药效试验和安全性试验，制备合格的样品送中检院复核，启动临床申报工作。(3) 复核通过后1224个月力争获得临床批件。（七）、知识产权情况Lilly公司的艾塞那肽注射液和阿斯利康的Bydureon均有较好的知识产权保护，并在市场上取得成功，Bydureon是艾塞那肽的制剂上改造，在分子结构上未作改进，本研究的重组rE4-Fc是利用基因工程技术进行改造，不再依赖复杂的化学合成；利用工程细胞株获得的rE4-Fc具有更高的生物活性，蛋白该有的相关修饰更为完整，半衰期进一步延长。并减化了制造工艺，降低了生产成本。针对该研究产品，已经完成申请专利的撰写。二、项目风险分析1.对同类产品形成明显的竞争优势，效果好，副作用小rE4-Fc与艾塞那肽、利拉鲁肽一样只有在正常血糖和高血糖条件下，才刺激胰岛素的分泌；在低血糖情况下， 无此作用，这点与传统的磺酰脲类降糖药不同。因此其在临床上发生低血糖副作用的风险会降低。但其具有分子量大，体内半衰期长，不需要像艾塞那肽注射液那样每天注射两次，利拉鲁肽每天注射一次，更是显著减轻患者给药带来的痛苦，患者对药物的依从性好，exendin-4融合Fc后也显著降低药物的免疫原性。患者对艾塞那肽的耐受性较好， 不良反应较轻，常见为轻度和中度恶心、呕吐以及其他症状，随着治疗的继续, 恶心、呕吐发生率和严重程度均会有所改善。2.国外研发进展使其获得临床批件和新药证书的可能性提高目前，批准上市的GLP-1受体激动剂药物有Lilly公司的艾塞那肽注射液、诺和诺德的利拉鲁肽、阿斯利康的Bydureon、GSK的Albiglutide等治疗II型糖尿病的药物。Lilly开发的Dulaglutide已经完成期临床，有望获得FDA批准上市。rE4-Fc的生物学活性明显高于GLP-1-Fc。因此，开发rE4-Fc获得临床批件和新药证书的可能性非常大。3.良好疗效及多适应症，具有较强的竞争力rE4-Fc不仅可以治疗II型糖尿病，而且还可以控制患者的体重，也可以用于多囊卵巢综合症(PCOS)的治疗。这是目前所有治疗糖尿病药物所不具备的功能。这一功能又将使rE4-Fc具有一个更大的市场。有利于rE4-Fc在整个竞争激烈的糖尿病药物市场中占据更大的份额。4.稳定的培养工艺，为其产业化提供了良好的保障本项目采用exendin-4与IgG4的Fc片段融合表达，构建了高效表达的CHO工程细胞株。工程细胞株经过连续40次传代，表达水平基本一致，纯批次表达量稳定在300mg/L。经过培基础养基筛选、流加组分筛选以及摇瓶培养工艺优化，初步建立了稳定的5L反应器培养工艺，简单流加培养至少可以达到500mg/L。在此基础上比较容易的进行中试优化、放大等工作，并进行三批稳定的中试生产。产品的体外细胞生物学活性检测均与有关文献一致、且5L培养产品批次之间性状一致。可以进行进一步的扩大生产。同时本项目有成熟的动物模型，从技术的角度和产业化规模方面，都将得到很好的保障。从这些情况来看，本项目开发重组rE4-Fc融合蛋白的成功率，以及在临床上的安全性是较高，市场风险也低。三、市场分析糖尿病是一种多样性的代谢性疾病，由胰岛素分泌障碍、胰岛素的作用障碍或两者同时发生而造成。胰岛素分泌量绝对或相对不足引起体内糖代谢、蛋白质代谢、脂肪代谢、水、电解质代谢等的紊乱。严重时病人血糖异常升高，产生脱水、迅速进入昏迷、休克、呼吸衰竭，死亡率达10%以上。目前全球糖尿病患者数已逾1.2亿，其中90%左右为型糖尿病，而此数字还在逐年上升，估计到2025年，世界范围将有3亿人患上糖尿病。单在美国，每天糖尿病发现病例就有2100例，每天有500名以上患者死于糖尿病。目前在中国已大约有超过9200万糖尿病患者，并以每年150-200万人增长，并呈现患者人群年轻化趋势。预计到2025年，我国糖尿病患者将达到1亿人。糖尿病一旦患病需终身用药，医疗花费巨大，中国每年用于糖尿病治疗费用达120-130亿元人民币。糖尿病治疗药物的研究是目前国际药物研究领域的热点，在最新生命科学研究的基础上，针对一些新的药物靶点，正进行大量的药物研究。目前在糖尿病的治疗中，主要根据糖尿病的不同阶段，采用抑制糖吸收、促进糖代谢的药物进行治疗，但是目前常用胰岛素、磺酰脲类和二甲双胍类等药物对患者血糖控制情况并不理想，用药患者的糖化血红蛋白（Hbalc）的平均值都8%，从而增加糖尿病患者发生肾病、致盲和心脏病等并发症的危险；且伴有体重增加、低血糖症、水肿等副作用。目前市场上急需一种理想的、针对II型糖尿病长期性治疗手段，用以阻止、延迟或逆转-细胞功能减退。这类治疗手段应该发挥出一种独特的作用机制，使之能产生一种辅助性的或与目前已有治疗方法的协同作用；不会引起体重增加、低血糖症或其它限制性的