体外重组技术唐旭东2013级

第五章,基因工程基本技术,概述,一、DNA重组技术相关概念,克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。,克隆化(cloning) 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。,DNA克隆(DNA cloning),应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子)-重组DNA 。 继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆，又称为基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloning)。, “克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA (recombinant DNA)。,实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinant DNA technology)，又称基因工程(genetic engineering)。,基因工程目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,二、DNA重组技术基本程序,外源DNA的获取,连接物（重组DNA)导入合适受体细胞,目的基因与载体的连接,克隆载体的选择与构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,分、切、接、转、筛,（一）按功能分类,（二）按受体细胞分类,（三）按载体来源分类,一、载体的分类,细菌培养,质粒扩增并表达蛋白质,大肠杆菌,染色质,质粒,定义: 是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子，是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。,二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)的特征,1. 质粒的特征,功能： 使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力。 性质：具有不相容性 按拷贝数分类： 严谨性（低拷贝） 松弛型（高拷贝）,克隆用质粒载体应具备的特点：,分子相对较小，具有较高的拷贝数 含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。 具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。,2. 质粒载体的分类: 克隆载体和表达载体 （1）克隆用质粒,抗药基因或营养代谢基因,氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码-内酰胺酶，水解amp -内酰胺环使amp失效 四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落变为蓝色。,*lac Z N端146 aa残基编码基因 *lac Z编码产物为半乳糖苷酶片段（N端）,突变型lac E. coli可表达该酶的片段（C端)，两片段单独存在无活性 *两端同时存在时有活性-蓝色化合物 互补（ complementation） *在Lac Z 基因内无外源DNA的插入，在含X-gal的培养基上生长时会出现蓝色菌落-阴性克隆。 *在Lac Z 基因内插入外源DNA,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落-阳性克隆。,X-gal,蓝色化合物,-半乳糖苷酶,Lac-Z基因,互补筛选-蓝白斑筛选,外源DNA插入,白色,IPTG诱导,异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类似物,互补筛选法-（237）,阴性克隆,阳性克隆,Ampr,ORI,Tetr,pBR322质粒：一种克隆质粒,ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。,结构：,Ampr, Tetr：,两个抗性基因用于 筛选阳性克隆。,Pst I, BamH I：,两个单酶切位点用于插入目的基因,Ampr,LacZ,MCS,pfxBlue: 克隆质粒,MCS：Multiple Cloning Site,提供多个单酶切位点用于克隆操作,LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆,pUC18/pUC19,*pUC18/pUC19的MCS方向相反,pMD-18 T simple克隆载体的结构,2. 质粒载体的分类:,（2）表达用质粒载体： 除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件：如启动子、终止子等 分类： 原核表达载体 真核表达载体,pET-32a(+)原核表达载体的结构,*pET系列的基本结构： T7启动子、MCS、T7终止子、Ampr等,*可将T7 RNA聚合酶基因置于lac启动子的控制下,pcDNA3：真核细胞表达质粒,Pcmv：,CMV增强子/启动子,驱动目的基因在真核细胞内表达,BGH pA：加尾信号,目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。,（二） 噬菌体,A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR,重组区,cos末端,cos 末端,A,R,A,R,EcoRI,目的基因,EcoRI,EcoRI,插入型,置换型,噬菌体作为载体具有两个特点, 噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。, 噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。,噬菌体的种类：,Charon系列、 gt系列、EMBL系列,（三）粘粒载体（cosmid),质粒序列：复制原点，抗性标志 噬菌体：cos粘端序列 插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍,（四） 酵母人工染色体载体(YAC),质粒pBR322衍生物,酵母基染色体,中心粒,端粒,复制起点顺序,复制起点(ori),Ampr基因,组成,用途,构建真核生物基因组DNA文库,能携带更大（1Mb）的插入片段,第二节,基因工程中常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE),是能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。,+,Bam H,定义：,切基因工程的手术刀,、（基因工程技术中常用型） 切基因工程的手术刀,分类：,一、限制性核酸内切酶,命名：,Hin d,Haemophilus influenza d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 识别顺序一般为46个碱基，通常为回文结构(palindrome) (核苷酸序列呈二元旋转对称,180反向重复）,切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,Hind,+,平端切口,粘端切口,平头或钝性末端（blunt end),粘性末端 （sticky end),产生5 突出黏性末端 (sticky end),EcoR I,产生3 突出黏性末端,Pst I,酶单位定义：,在适当反应条件下，1h内在50l体系中完全酶解1g特定DNA底物所需酶量，定为1个活性单位。,出售的内切酶几乎均以噬菌体DNA作底物测其酶活性单位。,酶切鉴定 ：琼脂糖凝胶电泳,二、DNA聚合酶,含3种酶活性：,1. 大肠杆菌DNA聚合酶I,5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性,催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5 3外切酶活性)-主要用途 DNA序列分析,应用：,二、DNA聚合酶,2. Klenow片段,随机引物标记法标记探针-主要用途 双脱氧末端终止法进行DNA测序 cDNA第二链的合成 DNA 3突出末端进行末端标记,用途：,(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段， 缺5 3外切酶活性) #38.,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸, 5核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,二、DNA聚合酶,PCR反应-主要用途 DNA测序,用途：,3. Taq DNA聚合酶(65kD),耐热， 在7075时具有最佳的生物活性， 无3 5外切酶活性(无校正功能） #40.,35外切酶活性的功能,校读（proofread）功能,17/62,将错配的核苷酸从引物链的3端除去,（1）反转录活性：即以RNA为模板合成DNA(主）,（2）RNase H活性：水解RNA-DNA中的杂合 分子中的RNA,（3）DNA-pol活性：以DNA为模板合成DNA,4. 反转录酶(Reverse Transcriptase, RT),二、DNA聚合酶,反转录病毒细胞内的逆转录过程,RNase H活性,单链DNA,三、DNA连接酶(DNA ligase) 基因工程的缝纫针,*催化双链DNA相邻碱基5-P和3-OH间磷酸二酯键形成的酶。,*T4噬菌体DNA连接酶-最常用,催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端) 5-P和3-OH之间形成磷酸二酯键。,*主要功能与用途：,催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。,修复双链DNA分子中单链缺口。,四、其他修饰酶,功能：,催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3-OH末端。,(一) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),用途：,1. 主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。,2. DNA 3末端的同位素标记。,催化DNA、RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解。,用途：,1. 在连接反应中去除载体DNA片段5-P，防止载体自我连接.,2. 用32P标记5末端时，用此酶去除5-P，再用激酶进行5的 32P标记.,(二) 碱性磷酸酶,功能：,(三) 多聚核苷酸激酶 (四) RNase (五) DNase,第三节,目的基因的获得和修饰,-分,一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因,从原核基因组中制备 从真核基因组中制备,二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因,获得已知的基因 构建RT-PCR文库法并获得未知基因 计算机克隆,三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选,基因组文库(genomic library，G文库)： 将基因组DNA用内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，再将其导入适当的宿主细胞， 宿主细胞中克隆载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库。,G文库构建方法：鸟枪法,分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,从基因组DNA文库获取目的基因,cDNA文库(cDNA library，C文库)： 将细胞内所有mRNA 逆转录为cDNA，再将所有cDNA片段克隆到适当的载体中 ，并将其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中含有不同cDNA片段的克隆载体混合物就是C文库。,C文库构建方法：,反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的,分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从cDNA文库获取目的基因,*由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,四、化学合成法制备基因片段,*已知序列用DNA合成仪,本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。,缺点：,2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序 列推测，难于保证与天然基因序列一 致，往往导致表达效率大大降低。,1. 只能合成较小片段的DNA,四、化学合成法制备基因片段,第四节,目的基因的载体连接,-接，分子克隆的核心,一、PCR产物的克隆策略,（一）限制性内切酶酶切位点添加法,*利用目的片段所特有的限制性内切酶识别位点对产物进行酶切分析。 *在设计PCR引物时要考虑到连接方式，直接在引物的末端包含与载体相匹配的限制性内切酶位点。,(二）T/A克隆法,*PCR产物的3末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中。,一、PCR产物的克隆策略,TA克隆方法(一步PCR克隆),PCR扩增,+,连接,转化,蓝白筛选,校正聚合酶,平端PCR产物,*不需酶切,*不受酶切位点的限制,（一）粘性末端连接法,用同一种 限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端,高背景(自身环化),双向(正、反)插入,单酶切,缺陷,二、外源DNA片段和载体的连接,#58.,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 16C 16 h,同一限制酶切位点连接,如何实现？,（二）平头末端连接法,质粒,产生平末端的 内切酶,DNA连接酶,产生粘性末端 的内切酶,核酸酶S1,目的基因,重组质粒,产生粘性末端 的内切酶,核酸酶S1,本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！,（三）人工接头法,用同一种 限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,+,+,DNA连接酶,接头(linker),本法适用于在质粒和 目的基因上没有相同的 酶切位点,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端而进行粘端连接。,（四）同聚物接尾法,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,内切酶,末端转移酶 +dGTP,末端转移酶 +dCTP,本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点,第五节,重组分子的扩增和鉴定,一、重组DNA分子导入受体细胞-转,宿主细胞或受体细胞： 定义：被导入重组DNA分子的细胞。 分类： 原核细胞：大肠杆菌、链霉菌 及枯草杆菌 真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞 要求： 容易接纳重组DNA分子 对载体的复制扩增无严格限制 不存在特异的能降解外源DNA的内切酶 不对外源DNA进行修饰,重组DNA分子导入方式： 转化(transformation) 将重组DNA分子导入原核细胞的过程。 转染（transfection) 将重组DNA分子导入真核细胞的过程。 感染（infection） 以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入原核或真核细胞，使目的基因得以繁殖的过程。,转化(transformation),转化的关键：感受态细胞的制备 感受态细胞（competent cell）：经理化方法处理而容易接收外源DNA分子的细胞。 转化的方法： 化学法（ CaCl2 法）：需感受态细胞 电穿孔法：不需感受态细胞 转化效率较高 但需特殊仪器,基因导入装置 (Bio-Rad),BTX ECM 2001多功能细胞融合仪,转染（transfection) 分类：瞬时转染 稳定转染：G418（Geneticin),方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔法 脂质体转染 显微注射,非转化子,转化子,非重组体,重组体,鉴定,单抗生素筛选,非转化子(不能生长）,转化子,阳性重组体 自身环化载体 未酶解完全载体 非目的基因插入载体,二、重组DNA分子的筛选、鉴定,（一）抗生素筛选,仅作为初步筛选,插入失活的双抗生素对照筛选法,*若目的基因插入抗生素抗性基因外部，重组质粒能在含该抗生素的培养基上生长,*若目的基因插入抗生素抗性基因内部，即引起插入失活，重组质粒不能在含该抗生素的培养基上生长,BamH I,DNA连接酶,重组质粒,目的基因,Ampr,Tetr,Pst I,目的基因与pBR322经BamH I酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？,思考题,用BamH I酶切,(插入失活法) 抗药性标记选择,在tetr（TcR)中插入外源DNA,ampr,插入失活的双抗生素对照筛选法,克隆3,5,7,9,10 是阳性克隆,Amp,转化子 非转化子 (不能生长),插入失活筛选法(120),(三）酶切电泳鉴定,琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切鉴定,快速小量提取质粒DNA,跑得慢-重组质粒,跑得快-空载体,（二）X-gal筛选-蓝/白筛选,见于pUC系列、 pEGM系列、M13,蓝色菌落：阴性克隆 白色菌落：阳性克隆 #75,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,重组CK2 亚基转化子的筛选 第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆; 第4,6,8号是阴性克隆,1. DNA/EcoR I+Hind 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III 3. recombinant plasmid /Hind III 4. pT7-7/ Hind III,重组质粒的酶切鉴定,（四）序列分析,*通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列作为测序时引物的结合位点-通用引物,*对于表达型重组子，插入片段必须是正确的序列，一般要进行DNA测序,ABI PRISM 310型 DNA测序仪,主要用于DNA序列分析,PE 3700型DNA测序仪,（五）其他方法,内切酶,重组DNA,目的基因,分离,电泳,印迹到NC膜,探针,放射性,非放射性,分子杂交,核酸分子杂交,覆盖 滤膜,取下沾 有菌落 的滤膜,裂解、 变性、 固定等,与探针 杂交,放射性 自显影,1 2 3,4 5 6,3和5是阳性克隆,菌落或噬菌斑原位杂交,菌落印迹杂交 (603),SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and Western blot,用已知的特异抗体检测目的基因蛋白,免疫化学检测（Western blot),重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,目的基因（外源基因）,基因文库,内切酶,化学合成,PCR产物,鉴定（酶切电泳、序列分析、杂交、Western blot等）,筛选,(抗生素、X-gal 等法),阳性重组体,第六节 外源基因的表达,表达体系的建立: 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程,一、外源基因在原核系统中的表达,大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用 表达载体：选择标志、多克隆位点 强启动序列、翻译调控序列 优点： 培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产。,原核表达系统的不足,只适合表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组D