提取及其定量分析

RNA的提取及其 定量分析,张 许 2014-10-22,主要内容,一、RNA的提取 二、逆转录体系,1、实验原理,2、注意事项,3、实验流程,三、荧光定量PCR,1.荧光定量PCR概念 2.荧光定量PCR原理 3.荧光定量PCR分类 4.荧光定量PCR实验方法,一、RNA的提取,氯化锂沉淀法 ：SDS 是一种去污剂，可以抑制内源RNA 酶的活性，它不但可解聚核酸与蛋白质的结合，还可与蛋白质带正电荷的侧链结合，形成SDS蛋白质复合物而沉淀。4 M LiCl可选择性沉淀RNA。 Trizol法 ：Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍（强变性剂）配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。 mRNA提取试剂盒: 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,1.实验原理,1、内含二硫键，变性后会迅速重新折叠。 2、不需二价阳离子激活。,一、RNA的提取,Structure of RNase A,2.注意事项,一、RNA的提取,RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。实验台面 等要彻底清理。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C.实验所涉及的离心管，枪头必须为RNA专用；处理RNA的移液器专用。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。,RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。,2.注意事项,一、RNA的提取,3.1匀浆化作用,组织 100mg，加 1mlTRIzol,匀浆（要彻底，后转至EP 管） 组织匀浆量100mg 时分装1ml/每EP 管,将匀浆样品在1530C 条件下 孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。,在加入氯仿之前（第1步）， 样品能于-60- -70保存至少一个月。,每510106的动物细胞，植物或酵母菌 细胞或每1107 细菌加1ml的TRIZOL ， 反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态。,一、RNA的提取,3 .3 RNA的沉淀,加等体积异丙醇（约400 -500l），混匀室温10 分钟,转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP 管中,4，离心12000g，10分钟，弃上清,RNA沉淀在离心前通常不可见， 形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。,一、RNA的提取,3.4 RNA的洗脱,加冰预冷的75%乙醇（用DEPC 水配）， 轻弹混合样品。,4离心7500g，5 分钟,弃上清，空气中干燥5-10 分钟（不能完全干燥）,RNA沉淀在75%乙醇中 于2-8能保存至少一周， 于-5- -20能保存至少一年,一、RNA的提取,3.5 RNA的再溶解,溶于 DEPC 水中至20l（10l-20l） （可在55-60水中，10 分钟助溶）,DEPC水中溶解的RNA于-70， 或置于冰上马上进行逆转录和PCR,DEPC水:是用1DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。经检测不含 RNase、DNase和proteinase。,RNA的质量检验,未降解的RNA在琼脂糖凝胶电泳后应该能看到三条带：28S rRNA；18S rRNA；由tRNA、5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊迁移较快的带，且28S的亮度应为18S两倍，且都没有弥散现象。如果孔附近还有明带，则表明产物中有DNA存在。,二、RNA定量技术,二、逆转录,1 逆转录（reverse transcription） 以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链，称为互补DNA（complementary DNA,cDNA)。,二、逆转录,RNA： 1000ug/CRNA H2O： 11ul-VRNA 5*First-Strand Buffer： 4ul dNTP Mix： 2ul dT: 1ul Rever tra Ace： 1ul Rnase Inhibition： 1ul TOTAL： 20ul PS: 5*First-Strand Buffer里含有氯化镁,RNA： 500ug/CRNA H2O： 5.5ul-VRNA 5*First-Strand Buffer： 2ul dNTP Mix： 1ul dT: 0.5ul Rever tra Ace： 0.5ul Rnase Inhibition： 0.5ul TOTAL： 10ul,2 逆转录体系,二、逆转录,实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 5RT Buffer在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时，请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。 Rever tra Ace是油性的，加之前应混匀，加之后要涡旋 dNTPs加之前混匀 。 Rever tra Ace和Rnase Inhibition用之前从-30冰箱中取出，使用过程中全程放冰上，用完即放回冰箱。,3 注意事项,三、荧光定量PCR,1 荧光定量PCR概念 所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。,2 荧光定量PCR反应原理,三、荧光定量PCR,X轴表示PCR循环数，Y轴表示扩增反应的荧光值,基线期：荧光背景信号阶段 对数期：荧光信号指数扩增阶段 平台期,恒定的Ct值,所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,2 荧光定量PCR反应原理,三、荧光定量PCR,2 荧光定量PCR反应原理,三、荧光定量PCR,理想的PCR反应： X=X0 *2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n 在扩增产物达到阈值线时: XCT =X0 (1+Ex)CT=M (1) 方程式(1)两边同时取对数得: log M=Ct*log X0(1+Ex) (2) 整理方程式(2)得: log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M(3) Log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环 数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,XCT:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M,3.1 特异性Taqman水解探针法,三、荧光定量PCR,Taqman荧光探针：一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。 在当探针与靶序列配对进行延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生.,3.2 非特异性SYBR Green I染料法,三、荧光定量PCR,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，可以根据荧光信号强度检测出PCR体系存在的双链DNA数量。,3.2 非特异性SYBR Green I染料法,三、荧光定量PCR,SYBR Green I作用机理示意图,4 实验方法,绝对定量 是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。 对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。 相对定量 是在相当量的试验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率,三、荧光定量PCR,三、荧光定量PCR,4.1相对定量分析反应准备,物品：引物稀释： 10倍：1ulF+1ulR+8ulddH2O 20倍：1ulF+1ulR+18ulddH2O 模板浓度：如果是首次实验,最好做浓度梯度，至少两个稀释度。 一般而言，Ct值在1530范围内比较合适。 ddH2O SYBR GREEN(避光) PCR专用八连管 枪（量程合适10ul） 枪头（进口枪头） 仪器: 定量PCR仪约时间、如果第一个做提前开机预热,4.2反应体系,三、荧光定量PCR,引物（上下游混合并已稀释好） 4ul 模板（稀释后的cDNA） 1ul Taq DNA聚合酶 dNTP 二价阳离子（Mg2+ 优于Mn2+ ） 一价阳离子（kcl） 缓冲液 SYBR Green,SYBR Green mix 5ul,三、荧光定量PCR,1、预变性的条件适用于热态启动的PCR反应过程中耐热性DNA聚合酶抗体的失活，轻易不要改动。 2、退火温度最好在55-65，取决于探针的解链温度；退火的时间一般5-20s，过长会降低效率，过短则会增加非特异性扩增 3、如果使用的探针或引物是从公司订购的，可以参考公司所推荐的条件。,4.3相对定量分析反应条件,三、荧光定量