《DNA的分子特性》PPT课件.ppt

1,一、核酸的分子结构,二、DNA的变性和复性,第二章 DNA的分子特性,2,一、核酸的分子结构,一）核酸的化学成分,二）DNA的一级结构,三）DNA的二级结构,四）DNA结构的多态性,3,1）核酸是由什么组成的？,核酸是生物体内的高分子化合物。,核苷酸,脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA） 核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）,DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的。,含氮有机碱(称碱基) 戊糖 磷酸,嘌呤：、 嘧啶：、,一）核酸的化学成分,4,碱基结构图,5,戊糖:RNA中是D核糖，DNA中是D2脱氧核糖,糖苷键的连接都是构型。,6,核苷nucleoside,7,核苷酸(nucleotide) 核苷的磷酸酯 核酸分子的结构单元 3核苷酸 5核苷酸,5磷酸腺苷的结构式,8,2）核苷酸是怎么连接的？,9,3，5 - 磷酸二酯,10,寡核苷酸（oligonucleotide) 指二十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。 使用时，对核苷酸残基的数目并无严格规定 寡核苷酸目前已可由仪器自动合成，作为DNA合成的引物（primer)、基因探针（probe)等,11,3）核酸链的简写式 表示的主要内容是核酸链中的核苷酸或碱基 两种常用的简写式,字符式 线条式,12,（1）字符式 英文大写字母缩写符号 碱基 小写英文字母p 磷酸残基 糖基、糖苷键和酯键等均省略不写 碱基和磷酸相间排列,13,例：DNA链和RNA链片段的简写式,5ppppppppp3DNA 5ppppppppp3RNA,可进一步简化为：,5p3 5p3,若5端不写p，则表示5末端为自由羟基。,14,双链DNA分子的简写式 省略磷酸残基，同时再增加一条互补链； 链间的配对碱基用短纵线相连或省略； 错配碱基对错行书写在互补链的上下两边。,53 35 5C（错配）,15,（2）线条式 垂线（位于碱基之下） 糖基 斜线（位于垂线与之间） 磷酸酯键,16,简写式表示的含义 核酸分子的一级结构 核酸分子中的核苷酸排列顺序,17,1）DNA一级结构的概念,DNA分子中核苷酸的排列顺序，又称碱基顺序,53 35,如：,二）DNA的一级结构,18,生物遗传信息：包含在碱基排列顺序中； 基因：DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位； 不同基因的功能各异，各自分布在DNA的一定区域； 基因的功能取决于DNA的一级结构。,19,2）DNA物理图谱,DNA链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶切片段在DNA链上的定位。 限制性内切酶识别DNA内特异序列 核苷酸序列不同，酶切图谱也不同,20,DNA物理图谱是DNA分子结构的特征之一,53 35,co,21,1）DNA双螺旋结构的主要依据,（1）50年代初的核酸研究现状使人们普遍接受的观点：多核苷酸的特定序列是遗传信息所在。,三）DNA的二级结构,22,（2）组成DNA的四种碱基的比例关系 1949-1951年间，Chatgaff应用紫外分光光度法结合纸层析等技术，对不同来源的DNA进行了碱基定量分析：,23,Chatgaff 对DNA碱基组成的研究结果 A、以摩尔含量表示， A=T和C=G； B、 不同物种组织DNA总碱基组成上有很大变化，表现在A+T/G+C比值的不同，但同种生物的不同组织DNA碱基组成相同； C、嘌呤碱基的总和与嘧啶碱基的总和相等。,24,(3)Wilkins及其同事Franklin等用X射线衍射方法获得的DNA结构资料 高度定向DNA纤维晶体 DNA结构螺旋周期性 碱基的空间取向,25,2）DNA双螺旋结构的要点,(1)主链(backbone),26,(2)碱基对(base pair) 碱基位于螺旋的内则 以垂直于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链糖基相连 同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对 配对碱基总是A与T和G与C。碱基对以氢键维系，A=T ，G = C。,27,(3)大沟和小沟：小沟位于双螺旋的互补链之间，而大沟位于相毗邻的双股之间。,(4)结构参数：螺旋直径2nm；螺旋周期包含10对碱基；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。,28,3）DNA双螺旋结构与DNA复制,双螺旋结构模型能够圆满地解释作为遗传功能分子的DNA是如何进行复制的； 半保留复制机制(semi-conservative replication)。 是生物体遗传信息传递的最基本方式,29,电镜下的DNA复制,30,四）DNA结构的多态性,atson和Crick以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维在92相对湿度下进行X射线衍射图谱得出的DNA称B构象。 研究表明DNA的结构是动态的,31,32,A构象：以钠、钾或铯作反离子，相对湿度为75时，DNA分子的X射线衍射图。 出现于脱水DNA中 出现于DNARNA杂交分子中 C构象：以锂作反离子，相对湿度进一步降为66，DNA分子的X射线衍射图。 仅在实验室中观察到,33,34,D和E构象：相对湿度进一步下降，同时DNA分子中G-C碱基对较少的X-衍射图。 不同构象DNA的共同特点 都是右手双螺旋 两条反向平行核苷酸链通过Watson-Crick碱基配对结合在一起 链的重复单位是单核苷酸 都有两个螺旋沟，即大沟与小沟,35,CGCGCG单晶的X射线衍射图谱研究 左手双螺旋 主链中各个磷酸根呈锯齿状排列 如“之”字形一样，称为Z构象 重复单位：二核苷酸 只有一个螺旋沟,36, ZDNA的形成 DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成。 嘌呤碱是顺式的 嘧啶碱是反式的 嘧啶糖苷链向外挑出 嘌呤糖苷键弯向小沟 ZDNA主链呈锯齿状或“之”字形,37, ZDNA生物学意义？ ZDNA的形成通常在热力学上是不利的。 静电排斥 解链位点 与基因调节有关 沟的特征在其信息表达过程中起关键作用 ZDNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化,38,DNA二级结构多态性的发现拓宽人们的视野 生物体中最为稳定的遗传物质可以采用不同的姿态来实现其丰富多采, DNA构象的可变性,39,二、DNA的变性和复性,一）DNA的变性 二）DNA的复性 三）核酸分子杂交,40,变性(denaturation)和复性(renaturation) 是双链核酸分子的两个重要物理特性。 是核酸研究中经常引用的术语。 双链DNA、RNA双链区，DNA: RNA杂种双链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子(heteroduplex) 都具有此性质。,41,一) DNA的变性,指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。 本质：氢键和疏水键断裂 部分的或全部的 可逆的或非可逆的 不涉及到其一级结构的改变,42,变性DNA 的理化及生物学性质,溶液粘度降低 溶液旋光性发生改变,增色效应或高色效应,DNA的增色反应,43,破坏双螺旋稳定性的因素 加热 极端的pH 甲醇 乙醇 尿素 甲酰胺,44,热变性使DNA分子双链解开所需温度 ( melting temperature) 很狭的温度范围内突发的跃变过程,熔解温度（Tm）,45,不同来源DNA间的Tm存在差别的原因,（A）DNA的均一性 DNA分子中碱基组成的均一性 待测样品DNA的组成是否均一,46,(B) DNA的(G+C)含量 (G+C)含量越高，即G-C碱基对越多，Tm值越高。 Tm与(G+C)含量(X)百分数的关系可用以下经验公式表示(DNA溶于0.2mol/L NaCl中)： X%(G+C)=2.44(Tm69.3),DNA的Tm值与G-C含量的关系,47,离子强度低，Tm值低，融点范围宽 离子强度增高，Tm值增高，融点范围变窄 DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/ NaCl溶液中较稳定。,（C）溶剂的性质,48,二) DNA的复性,指变性DNA 在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。 是变性的一种逆转过程 经缓慢冷却即可复性，又称为“退火”,49,热变性过程和两种冷却过程示意图,50,影响因素,a）温度和时间 比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件 越远离此温度，复性速度就越慢,复性时温度下降必须缓慢 降温时间太短及温差大不利于复性,51,b）DNA浓度 复性速度与DNA浓度的平方成正比,52,c）DNA顺序的复杂性 顺序越简单，配对越快。,DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性越慢。,盐浓度越高，复性速度越快。,d）DNA分子的大小,e）溶液的离子强度,53,三）核酸分子杂交,分子杂交(hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。 基本原理： 应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子。,54,杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。 杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性(加热或碱处理)，使双螺旋解开成为单链，因此，变性技术