《RNA的转录》PPT课件.ppt

第三章 从DNA到-转录,表达系统三种物质的基本功能 DNA:贮存、传递 RNA:贮存、传递、酶 PRO:贮存、传递、酶,RNA 的转录,1 与RNA转录有关的概念 2 转录的基本过程 3 转录机器的主要成分和功能,RNA的转录:transcription 酶：转录是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP） 编码链（有义链coding strand ）：与mRNA序列相同的那条DNA链 反义链（无意义链，负链，antisense ）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链 增强子：Enhencer 启动子：Promoter 终止子：Terminator 转录单元： 转录区：,一、 与RNA转录有关的概念,上游：Upstream 下游：Downstream 初级转录本：Primary transcript,二、转录的基本过程,模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA作用并与之结合。在DNA上形成转录泡。 通过启动子：转录起始后直到9个核苷酸短链 的形成。 转录延长： RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并产生新RNA链伸长。 终止：不再形成磷酸二酯键，RNADNA分离，转录泡瓦解，DNA恢复双链。,酶对启动子的识别是转录的第一步 大肠杆菌启动子：在转录开始位置的上游10个和35个核苷酸位置有两段DNA的序列比较保守，分别称为10序列（10 sequence）和35序列（35 sequence）。,、模板的识别-原核,1. Pribnow box (-10 box),5 TATAA T 3,2. 35 box, GACA ,T85T83G81A61C69 52T89A89T50A65A100,转录起始位点、-10区、-35区、-10区与-35区之间的间隔。 原核基因转录起始位点通常是嘌呤，其序列为CAT（A为起始位点）。 -10区是一个6碱基保守序列（常以-10为中心）。 -35区是另一个6碱基保守序列（常以-35为中心） 当-10区和-35区中心位置相距16-18bp时，该启动子的功能较强；相距较近或较远时，起始转录的功能都相应减弱。,T85T83G81A61C69 52T89A89T50A65A100,原核启动子四大要素,全酶由个亚基组成，去掉亚基的部分称为核心酶，核心酶本身就能催化苷酸间磷酸二酸键形成。利福平和利福霉素能结合在亚基上而对此酶发生强烈的抑制作用。亚基似乎是酶和核苷酸底物结合的部位。亚基的功能是辨认转录起始点的。亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。亚基可能与转录基因的类型和种类有关。,大肠杆菌聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶 亚单位 分子量 亚单位数 组分 功 能 36512 2 核心酶 决定哪种基因被转录 核心酶组装 150618 1 核心酶 与转录全过程有关 形成活性中心 155613 1 核心酶 结合DNA模板 70263 1 因子 识别不同的启动子,启动子选择：RNA聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物 开放复合物形成： 亚基与-10区紧密结合，确认转录起始点，DNA解链形成开放复合物 开放复合物与最初的两个NTP结合并在这两个核甘酸之间形成磷酸二酯键后转变成包括RNA聚合酶、DNA、新生RNA的三元复合物,8-14亚基 种类 分布 合成的RNA类型 对-鹅膏蕈碱的敏感性 核仁 rRNA 不敏感 核质 hnRNA 低浓度敏感 核质 tRNA，5sRNA 高浓度敏感 Mt 线粒体 单亚基，与类似 不敏感 Ct 叶绿体 多亚基，与细菌类似 不敏感,真核生物的RNA聚合酶,模板的识别-真核,顺式作用元件(cis-acting element) -35区 5 -TATA Hogness盒 TATA盒 -70-80区 CAAT盒 -100区GC盒 反式作用因子(trans-acting factor) 转录因子（） 转录起始复合物 、 起始前复合物（）,PIC,转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生：酶与启动子结合后，并在RNA聚合酶（？）的催化下使DNA的双链解离，形成转录泡，为RNA合成提供单链模板，并按碱基配对原则，结合核苷酸，在核苷酸之间形成磷酸二脂键（起始复合物）。 转录起始后直到形成9个核苷酸短链，是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般来说，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。 当RNA链伸长到89个核酸后， 亚基解离，起始完成，进入RNA的延伸阶段 .,2、转录的起始,转录的延长阶段，原核生物与真核生物之间没有太大差别。,、RNA链的延伸,、转录的终止,不依赖于因子的终止作用 依赖于因子的终止作用,两类终止信号有共同的序列特征，在转录终止之前有一段回文结构，之间由几个碱基隔开 不依赖因子的终止序列中富含GC碱基对，其下游6-8个A； 依赖因子的终止序列中GC碱基对含量较少，其下游也没有因固定的特征，,不依赖于因子的终止作用,当RNA聚合酶转录到发夹结构时发生一定时间的停顿，这时如果没有因子，转录将会继续下去；只有当因子存在时，转录才终止。,依赖于因子的终止,因子是一个相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于催化了NTP的水解，因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,5、抗终止,、破坏终止点结构色氨酸操纵子中弱化子 、依赖蛋白因子噬菌体蛋白87,能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件（其核心序列常为8-12bp) 增强子的作用特点： 1能(通过启动子)提高同一条链上的靶基因转录速率； 2增强子对同源基因或异源基因同样有效； 3增强子的位置可在基因5-上游、基因内或3下游序列中； 4自身没有5-或3-方向性； 5增强子可远离转录起始点(最多30Kb)； 6增强子一般具有组织或细胞特异性,、增强子(enhancer),表1 RNA加工反应的分类,引自Advanced Molecular Biologiy:A Concise Referencetabl 27.1，Richard M .Twyman,BIOS Scintific publishers limited,1998,三、转录后的加工,基本概念,大部分真核RNA含有内含子，大小不等，叫hnRNA ， 初始转录本经加工切除掉内含子，产生成熟的mRNA。内含子的切除发生在前体mRNA和核内小分子核糖核蛋白（SnRNPs）的复合物中。这个复合物称为剪切体（spliceosome）。snRNPs中含有snRNAs和各种蛋白。 tRNA的前体分子5端含有前导序列（Leader）和3端拖尾（trailer sequences）序列。有的真核前体-tRNA含有内含子，内含子的切除与mRNA含内含子的切除机制是不同的。 真核的18S，5.8S和28S rRNA是属rDNA上的同一个转录单位。此前体rRNA序列之间含有间隔序列（spacer sequences）。 在有的前体rRNA中有内含子存在。这些RNA折叠成二级结构，加工时可自我剪接，这些内含子称1类内含子，自我剪接时不需要任何其他蛋白。 转录后的加工（posttranscriptional modification）是指将各种前体RNA分子加工成成熟的各种RNA。 在真核中还有第四种RNA分子即sn RNA,同样也是转录的产物。 加工（processing）有三种形式： 减少部分片段：如切除5端前导序列，3端尾巴和中部的内含子； 增加部分片段：5加帽，3加poly(A)，通过归巢插入内含子； 修饰：对某些碱基进行甲基化等。 以指导RNA（gRNA）为摸板在mRNA上插入或删除一些碱基，其作用是增加信息量，校正遗传信息和调控表达。 内含子有型、型和核mRNA内含子三种类型。它们的剪切机制各不相同。有的内含子可编码成熟酶和内切酶。,5-端帽结构 0型帽子(m7GpppG) 型帽子(m7GpppG m5, m7A) 型帽子(m7GpppGm5 m7A m5,A) 3-端 poly A尾巴的生成,核酶(Ribozyme)有的译成为核糖拟酶，核酶等，目前尚无统一的译法，暂以核酶称之，既简单明确，也能反映其酶的本质。 核酶是T.Cech等（1981年）在研究四膜虫rRNA时发现的，1982年T.Cech将核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”,它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类物质，这类物质具有催化功能，但和酶又有区别，主要表明在两个方面： 一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA； 核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变。,（一）. 核酶,原核的tRNA初始转录本多为多顺反子（polycistron），有三种不同的情况：串联的tRNA分子都是相同的，如在27的tRNATyr-tRNATyr； 串联的tRNA分子是不同的，如71的tRNAIle-tRNAAla-tRNAThr； 由tRNA和rRNA串联组成。少数的tRNA前体为单顺反子（monocistron）如43的tRNAser（图13-1）。,第一种、tRNA的加工（原核）,tRNA的加工分成3个阶段 (1)“斩头”，形成5末端。RNaseP由蛋白和RNA组成，具有内切酶的活性，可切除E.coli前体tRNA 5端的前导序列（41nt），此酶识别二级结构发夹所组成的tRNA。这就是S.Altman提出的外部引导理论。处在底物内的高级结构区，可供RNase识别，最终仍存在于成熟产物中，此tRNA的高级结构就称为外部引导区； (2) 去尾，形成3-OH末端。此过程由内切酶和外切酶的共同参与。前者识别发夹结构，后者识别CCA序列，但还不知道是哪一种核酸内切酶。对于具有CCA末端的1型tRNA前体修整3端的外切酶是RNase D，在CCA末端它一次切除（或逐步切除）3的碱基。对于没有CCA序列的2型tRNA前体分子来说，还不清楚是通过何种RNase外切酶来切。,图13-1 三种tRNA前体的剪切,(3)修饰：在前体tRNA的一些专一部位的碱基需要通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰成为特殊的碱基，如氨基酸臂上5的4-硫尿苷（4tu），D臂上的2甲基鸟苷（2mG），TC臂上的假尿苷（）以及反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA）,图13-3 tRNA 前体特殊碱基,真核tRNA的基因和原核不同： 真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区。如在爪蟾中每个基因组中各个tRNA基因超过200拷贝，是一种重复序列； 真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因； 5端都有单磷酸核苷酸，表明已被加工过； tRNA的前体分子中含有内含子，其特点是：,真核的tRNA的加工,图13-6 酵母tRNAPhe内含子的结构（引自B.Lewn: ,2000）,位置相同，都在反密码子环的下游； 不同tRNA的内含子长度和序列各异； 外显子和内含子交界处无保守序列，不符合Chambon法则，故其内含子的剪切是依靠RNase异体催化。进行剪切（见本章第四节）； 内含子和反密码子配对形成茎环，改变了反密码子臂的结构，保护了反密码子，使其免受某些酶的降解。,真核tRNA的加工和原核有区别：真核tRNA前体中无二聚体和多聚体； 增加了剪接内含子的过程； )都要加CCA。 真核tRNA的加工多以酵母为材料进行研究。同样通过诱变可以获得tRNA加工的温度敏突变型，来获得未加工的tRNA前体，然后在体外加入野生型酵母细胞的抽提物和ATP来观察，结果发现酵母tRNA的加工主要分成二步：,1 内含子的切除 酵母tRNA在未处理前先进行凝胶电泳，结果只显示一条带，且跑得较慢，表明此tRNA的前体分子；当加入核酸内切酶后无需加入ATP，反应后再走电泳，结果出现二条带，一条是剪切后游离出的内含子，另一条是互补的外显子，称为tRNA的半分子（tRNA half-molecules）。,真核tRNA内含子的切除和其他内含子的切除是不同的即没有交界序列，也没有内部引导序列； 是依赖于蛋白质性的RNase，而不是核糖拟酶或snRNP；反应的本质不是转酯反应。 真核tRNA内含子的精确剪切不依赖内含子的序列和大小，内含子的突变并不影响剪切。原则上是依赖对tRNA共同的二级结构的识别，而不是内含子的保守序列。分子不同部分的区域对于剪切是重要的，包括受体臂，D环，TC环和反密码子环。,图13-8 酵母tRNA前体的体外剪切（引自B.Lewn: ,2000）,2连接外显子 切除tRNA内含子的核酸酶很特殊，不是形成3-OH和5-P，而是产生了2-3环磷酸和5-OH，因此不能直接连接。此步反应无须ATP，但必须通过环磷酸二酯酶（phosphodiesterase）将2-3环磷酸打开，形成3-OH，2-P。5端须在激酶作用下将5-OH磷酸化，再通过连接酶将两个半分子连接起来。5磷酸化需要ATP的参加。哺乳动物的tRNA连接酶可将2-3环磷酸与5-OH直接连接起来，无需环磷酸二酯酶和激酶的介入。,在E.coli中rRNA有7个转录单位，名为rrnA-G，它们在染色体上并不紧密连锁。每个转录单位都含有16S、23S、5S RNA及一个或几个tRNA。但tRNA的数量，种类及位置都不固定，或在16S RNA和23rRNA之间的间隔序列中，或在3端5S rRNA之后。 每个转录单位转录成单个的RNA前体分子，经剪切后变成为成熟的RNA的分子。在16S和23S之间是400-500bp的转录间隔序列（TS）。在此区域中有一个或多个tRNA基因。rRNA前体的加工是由RNase 负责的。在rnc- 的细胞中不存在成熟的rRNA，只积聚了30S的前体rRNA分子。这种前体分子在体外能被RNase 切成成熟的16S，23S和5S rRNA（图13-4）。,图13-4 原核生物rRNA的加工(转引自Russell,1992),rRNA前体的加工（原核）,真核初始转录本为45S前体，18S，5.8S和28S 串联，5S RNA是和它们分开转录的。 真核的rRNA没有内含子，无需剪切。 真核生物rRNA前体的加工过程要通过4个阶段，所以速率相对较慢，因此主要的中间产物可从各种细胞中分离出来。 从哺乳动物的中间产物的大小来看rRNA前体的加工可能有多种途径，但并不是所有的途径都已搞清楚了。,图13-9 酵母rRNA前体的剪切(转引自Russell,1992),真核rRNA的加工,图13-9表明HeLa（人类）细胞和L（鼠）细胞中rRNA的加工途径： 切除5端的前导序列，即外部的转录间隔序列（ETS），变成41S的中间产物； 从41S的中间产物中先切下18S的片段，但Hela细胞途径和L途径不同，前者的切点在18S和5.8S之间的内部转录间隔序列（ITS），产物分别为20S（含18S rRNA片段）和32S；而后者的切点在18S序列和ITS的交界处； 部分退火：两种途径中的32S和36S中间产物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之间进行退火，形成发夹结构； 最后修正：ITS切除，32S中的ITS切除 尚不知道加工的细节；但已知道45S RNA立即和蛋白质结合，在核糖体上进行加工。,RNase 由2个亚基组成，不含RNA，起内切酶的作用。它可能识别一级结构和二级结构相结合的某种特 征。在30S前体RNA中，P16S和P23S各自的5和3都能互补配对，形成含有1600nt和2900nt的茎环，RNase 在二者的茎上交错切割（图13-5）（而不在单链泡上切开）产生了P16S，P23S和P5S rRNA前体。再进一步由外切酶进行修正，切除多余的部分形成各种成熟的rRNA分子。,突破了酶的概念.人们一直笃信具有蛋白质性质的酶才能催化生化反应，核酶的发现使人们了解了RNA本身也可具有催化功能，但和酶的催化机制不同，是一种自体催化； 揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。 为生命的起源和分子进化提供了新的依据。核酶反映了进化的早期阶段RNA既是信息的载体，又具有催化的功能，在进化的过程中这两者开始歧化，将携带信息的功能交给DNA，使得遗传信息更为稳定、丰富；将催化的功能交给蛋白，使得催化功能更为特异和多样。,核酶的发现是分子遗传学和生物化学中的一项重大突破,核酶催化的反应分为自体催化和半自体催化两类 自体催化包括 类内含子的自我剪接； 型内含子的自我剪接； 植物类病毒和拟病毒的自我剪切。 半自体催化包括： 核mRNA内含子的剪接； 锥虫SLRNA的反式拼接； tRNA5加工，此项不属于转酯反应，但也是核酶的活性之一。,除核酶之外，核酸酶和由内含子本身编码的成熟酶也参与某些内含子的剪切，如真核tRNA内含子和酵母cob基因的内含子2的剪接,不同类型内含子的结构特点和剪切/剪接反应,Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点，发现有2个特点：内含子的两个末端并不存在同源或互补序列。在剪切的初始阶段，可能直接连接； 连接点具有很短的保守序列也称为边界顺序。内含子的5端都是GT；3端都是AG，因此称为GT-AG法则（GT-AG rule），又称为Chambon法则。这两个位点序列是不同的左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。这两个位点对于剪接是十分重要的，一旦发生突变无论在体内还是在体外，会抑制剪接。此法则几乎适合于所有真核生物的核基因，这意味着它们切除内含子的机制是相同的，但不适用于类内含子。,（二）、边界顺序,型自我剪接内含子在线粒体基因组中发现，也存在于极少数单细胞真核生物(如嗜热四55膜虫的rRNA)的核基因组中。原核体系中少数内含子也是型内含子（如T4噬菌体胸苷酸合成酶基因）。,（三）型内含子的剪接,Cech等,1981,四膜虫（Tetrahymeno thermophila） 分离得到了35S的前体rRNA，它含有一个长413bp的内含子。 当将这个35S rRNA无论是否加入核的抽取物，只要加入一价或二价阳离子及GTP就可以在体外释放出413b的线性内含子，若继续保温，那么线形内含子又可形成环状的RNA。 为了防止少量酶含在其中造成假象他们又用了大量的SDS-酚来抽提，以较彻底地脱蛋白，或用蛋白酶来处理，但结果仍然可以自主剪接（self-splicing or autosplicing）。 用重组DNA技术将四膜虫rRNA基因中413bp与其两翼的序列进行分子克隆，然后再进行体外转录，用SDS-酚来抽提，由于细菌中没有能切除真核内含子的酶类，加之SDS-酚抽提应当说已十分雄辩地证实了四膜虫rRNA内含子具有自我剪切的功能。,1982,Cech小组,四膜虫35S rRNA自我剪接的模型（图13-22），其本质是转酯反应。用同位素标记的GTP加入到分离的35S rRNA中，发现它留在413nt的内含子内，因此推测GTP上的3-OH对内含子5和外显子交界处的U-A之间的磷酸二酯键，发起亲核进攻，切下外显子，而其3-OH和内含子5端（G）的磷酸形成了新的磷酸二酯键，从而结合到内含子上，这就是转酯反应（图13-24）；切下的外显子，3端的-OH基又对内含子3端交界的磷酸二酯键作亲核进攻，切下414nt的内含子， 而和外显子2以新的磷酸二酯键相联。切下的414（413 1VS加上外加的鸟苷）内含子其3-OH又对本身5端第15、16两个碱基之间的磷酸二酯键进行亲核亲核进攻，切下15nt的小片段，余下的399nt的间插序列（interveling sequence，IVS）（即内含子）首尾相连而呈环状；环形内含子可进一步水解，在首尾相接处切开磷酸二酯键，成为399nt线形内含子，因为已丢失了15个nt，故称其为L-15IVS，L是“lose”的缩写。L-15 IVS 3端的-OH再次对其本身5端第4-5碱基之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切下4个nt的小片段，余下环形的395Nt内含子，经再次水解，产生了395nt线状的内含子，因前后一共丢失了19个nt的小片段，故称其为L-19 IVS。,1986年女科学家Grabowski,P.J.发现L-19可以催化5聚胞苷（5XpC）聚合为多聚胞苷（图13-23）更加无可辩驳地证实了四膜虫rARNA内含子确实具有酶的催化功能，建立一种崭新的概念“核酶”。,类内含子的结构特点是：其边界序列为5 U G3（表示剪切位点）；具有中部核心结构（Central core strucature）。 所有的类内含子中都具有2级结构图13-24，共九个配对区（P1-P9）其中有2个配对区（P4和P7）是类内含子中共有的保守序列，P4由P和Q序列形成，长10nt，有6-7碱基是可以配对的。P7是由R和S序列构成的，长12nt，但只有5个碱基可配对。其他的配对区在不同的内含子中是不同的，突变分析表明，P3，P4，P6，P7是核心结构，也就是可以执行催化的最小区域。 具有内部引导序列（internal guide sequence IGS）,图 13-24 1类内含子中含有的共同的二级结构,类内含子的结构特点,内部引导序列，由六个nt组成，GGAGGG。内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导序列。现在认为IGS作用是决定剪接的专一性。而且使切点的U处于易于受到攻击的暴露点。有的序列很短，在P7和P9之间配对，要在内含子3端G激活前立即配对。,碱基的配对对于产生核心结构是很必要的，顺式作用位点的突变就会阻止类内含子的剪接。各种突变的线粒体内含子在体内都不能被切除，而四膜虫的内含子插入到细菌基因中，再转化到细菌中，它仍可以剪切。 图13-25表示构建一个重组DNA，转化到在E.coli中表达。将自我剪接的内含子插到-半乳糖苷酶的第10个密码中，再转化-gal-E.coli，若此内含子不被剪接的话，-半乳糖苷酶基因受到破坏不能表达，菌株为白色，若能自我剪切，则-半乳糖苷酶基因可以翻译成完整的酶，能使底物X-gal发酵变兰。用此方法可以检测内含子是否具有自我剪接的活性。,类内含子的剪接机制,内含子的二级三级结构形成了G苷酸结合位点和底物结合位点，后者依赖于内部引导序列的配对来确定。核心结构和内部引导序列又使这两个位点彼此靠近，便于相互作用。,首先是GTP进入G结合位点，左边外显子的3端通过和引导序列的互补配对进入底物位点。GTP的3-OH作用左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键，本身结合到内含子的5末端，被切下的5外显子仍保持在底物位点上，并未游离。 第二步内含子的G414（即3交界序列上的G）又进入了G-结合位点，切下的外显子的3-OH又对G-结合位点上的G与3外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切开磷酸二酯键，而其3-OH和3外显子的P重新形成磷酸二酯键而连接起来，这样就完成内含子的剪接。内含子成为线形的413nt的RNA分子。 第三步，内含子5端和引导序列相邻的序列通过引导序列互补配对，进入底物位点。仍然留在G结合位点上的G414其3-OH再作用底物位点上的序列，切下19nt的内含子5端，并和余下内含子的5-P形成二酯键，形成414nt的环状内含子。,、结构特点 （1） 列为5GUGCGYnAG，符合GT-AG法则。 （2）二级结构的形成使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被2碱基隔离开。 功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2-OH首先进行转酯反应。 （3） 在内含子的近3端具有分支点顺序（branch-point seguence），也就是在第6功能区有6-12nt保守序列，在哺乳动物中为YNCURAY（Y：嘧啶，R：代表嘌呤，N表示任何核苷酸）。分支点顺序可和上游序列互补，形成茎环，但A不配对（图13-27）。,（四）、类内含子的剪接,型内含子在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现。类内含子的剪接和I类内含子不同，而和核mRNA 内含子的剪切有些相似。但也有不同之处。,图13-27 II型内含子的结构特点,()剪接机制,图13-28 II型内含子的剪切机制,类内含子的剪接无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。首先是分枝点A的2-OH对5端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻（图13-28）切下外显子1，内含子5的边界序列上的G与5磷酸和分枝点A的2-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构；第二步是切下的外显子1，其3-OH继续对内含子3端的交界序列进行亲核进攻，切下的外显子2的5磷酸和外显子1的3-OH形成磷酸二酯键，连接在一起，同时释放出套索状的内含子。,和类内含子十分相似，但根本的不同点是核mRNA前体的剪接本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。和snRNA的结合是相当复杂的，但剪接反应的第一步5位点的剪接是由U6催化的，3位点是由5外显子1的3-OH对内含子3端切点进行转酯反应来完成。,图13-29 核mRNA剪切过程,(一) 结构特点 1. 边界顺序:其边界序列是完全符合GU-AG法则。 2. 分枝点顺序：它和类内含子相似也具有分枝点顺序。位于内含子3端上游18-40nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95其中A为百分之百的保守，且具有2-OH。 3. 内含子5端有一保守序列（5GUAAGUA3）可以和U1 snRNA的5端的保守顺序3CAUUUCAU5互补（图13-29）。,（五）. 核mRNA的剪接,表2 几种不同内含子剪接反应的区别,以上几种内含子的剪接机制是不同的，现总结如表2所示,内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，称为顺式剪接（cis-splicing），但也有另一种情况，即不同基因的外显子剪接后相互连接，此称为反式剪接（trans-splicing） 较少，较典型的是锥虫表面糖蛋白基因VSG(variable surface glycoprotein)，线虫的肌动蛋白基因（actin genes），和衣藻（chlamydomonas）叶绿体DNA中含有的psa基因（植物光合系统基因）。,（六）反式剪接反应,图13-33 锥虫反式拼接的过程,Von der Ploeg等（1982年）发现在锥虫（Trypanosome）中许多mRNA的5端都有共同的35b前导序列，但在每个转录单位上游并未编码这个前导序列. 1986年Murphy.W.J.和Sutton,R.E.证实此是一种反式拼接。这种前导序列来源于基因组中位于别处的重复序列所转录的小片段RNA，每个重复单位长135nt，前面35nt的前导序列可以通过转酯反应加到VSG mRNA的5端。其反应机制和核mRNA内含子的剪接是相似的。在VSG mRNA右侧内含子上有分枝点位点，可以和重复序列的内含子相连接。因为这两段序列是反式结构，所以形成Y型中间体而不形成套环，用去分枝酶处理就可以得到两个片段，若是套环的话就会得到一条片段。切下的5外显子，即35nt的前导序列的3端可以再