《RAPD分子标记技术》PPT课件.ppt

,分子标记的类型,基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）。 基于 DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）。,基于 PCR的分子标记，它又分为两类： RAPD （Random amplified polymorphic DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） 微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter simple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site),位点特异的PCR标记方法,多位点标记方法,基于PCR技术的DNA扩增方法,RAPD标记的原理,RAPD标记的操作步骤,RAPD标记特点及应用,RAPD标记,1,2,3,RAPD标记简介和原理,1,RAPD标记的操作步骤,2,（1）随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD） 简介：RAPD是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术。 原理：该技术利用大量的、各不相同的，碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物(约810 个碱基) ，以待研究的基因组DNA片段为模板，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，可对基因组DNA进行多态性分析。,RAPD标记简介和原理,1,RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段。 一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。,PCR,RAPD,Primer binds to many locations on the template DNA Only when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point toward each other will amplification take place,RAPD,RAPD,Template DNA,Primers point in the same direction, so amplification wont happen,RAPD,Template DNA,Primers too far apart, so amplification wont happen, 2,000 bases,Template DNA,Primers are just the right distance apart, so fragment is amplified,100 - 1,500 bases,RAPD,Separated RAPD Fragments,Normal concentrations are shown in yellow text. M = A size standard,Lowering Magnesium ion concentration results in loss of the largest fragment visible in lanes 2-7,RAPD reactions were run in groups of 3 using the same template and primer, but varying Magnesium, polymerase and primer concentrations,Which variable has the greatest impact on fragment patterns?,1.模板DNA的制备与调整 根据实验材料的不同，采用相应的DNA提取方法提取基因组总DNA（gDNA）DNA沉淀经溶解稀释后琼脂糖凝胶电泳检测OD值，确定提取的质量和浓度，最后将合格的提取液浓度调整一致，保存备用。,RAPD标记的操作步骤,2,2.各组分的混配 按照反应体系各组分的反应比例，充分、迅速、有序的添加各种成分，一般家加样顺序：模板25ng、引物15ng、dNTP0.1mm、10反应缓冲液2微升、氯化镁2mm,最后加入Taq酶，以双蒸水补充体积至25微升，混匀后20微升矿物油覆盖。,3.DNA扩增,将盛放以上各组分的离心管放在DNA扩增仪上按反应程序设定进行DNA扩增，经过3545个循环，将ng级的模板DNA扩增到mg级。,4.扩增产物的分离检测和记录,扩增结束后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，电极缓冲液采用1TAE（0.04M Tris-乙酸、0.001M EDTA） 电压80100V。电泳结束后，凝胶放入0.5%EB染色2030min，然后放在中等波长紫外光下观察记录、照相。,综上，操作过程概括如下：,RAPD标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，设计引物无须知道序列信息； （2） DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。,RAPD标记特