《SNP检测方法讲课》PPT课件.ppt

1,SNPs的检测方法,唐敏 2005.8.12,2,主要内容,SNPs的定义 SNPs的研究意义 SNPs的研究进展和方向 SNPs的检测方法,3,SNPs的定义,定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 (99.9%),4,SNPs的研究意义,1. SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_路标的作用 传统研究策略（表征、蛋白、基因） 逆向遗传学（表型、基因、蛋白），,5,2.基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别）,6,SNPs研究进展和方向,1. SNPs数据库的构建发现 2. SNPs功能的研究（在1的基础上）,7,SNPs检测方法,1.理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs (1) 灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧） (2) 快速、简便、高通量 (操作和分析的自动化程度高） (3) 费用相对低廉,8,2.现状： 到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。,9,3.每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。,10,SNPs检测方法的分类,一、区分SNPs 位点的方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法,二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术,11,1.基于杂交的方法,原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。 （差异越大，检测的特异性就越好）,12,1）利用Tm,固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH),13,核酸肽探针 （Peptide nucleic acids，PNA),其骨架是肽键 特点： 1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响） 2、链挤入 （形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面） 3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）,14,1、与靶分子高特异性地结合,Tm值高 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。,15,LNA(locked nucleic acids),其结构是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。 特点： 1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配的Tm增加,16,DASH (dynamic allele-specific hybridization）,17,2）杂交+荧光共振,分子信标（双分子间杂交） 蝎状探针（分子内杂交）,18,分子信标（Molecular beacons）,19,蝎状探针 （Scorpion primer）,20,2.基于酶的方法,1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H,21,1）DNA聚合酶,等位基因特异性PCR 多重等位基因特异性PCR Taqman法 引物延伸法 焦磷酸测序法,22,等位基因特异性PCR,23,Taqman 法,24,微测序法/引物延伸法,25,基本步骤（液相）,1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA 2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP) 3.引物延伸 4.延伸产物检测（ 放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、 质谱分析法、变性高压液相色谱法等）,26,APEX (arrayed primer extension)固相,27,焦磷酸测序法 (Pyrosequencing ),DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶( apyrase) 。 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。,28,基本步骤,1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。 2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。 3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 4. ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 5.然后加入下