实时荧光定量PCR一般流程.ppt

LU Yang Application Specialist Gene Company Ltd,实时荧光定量PCR一般流程,内容,实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材,实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材,未知样品中目的基因绝对量：绝对定量 比较不同样品中目的基因相对表达量：相对定量 检测未知样品基因型：SNP分析 检测未知样品中某种成分的存在与否：存在/不存在分析 ,实验应用目的,不同实验应用，实验准备不同,未知样品中目的基因绝对量,标准品： 已知确切浓度，分子结构和目的基因类似 梯度稀释： 至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围 样品重复： 每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义 标准曲线： 斜率和标准差必须要符合数学意义,不同实验应用，实验准备不同,比较不同样品中目的基因相对表达量,内参基因：用于数据均一化 扩增效率比较： 比较内参基因和目的基因的扩增效率，以确定相对定量的不同定量模式 Slope 0.1，使用相对标准曲线法 Slope 0.1，可以使用比较CT值法,不同实验应用，实验准备不同,比较不同样品中目的基因相对表达量,Slope 0.1，使用相对标准曲线法 标准品：内参基因和目的基因，不需知道样品确切浓度 浓度梯度： 至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围 样品重复： 每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义 标准曲线： 斜率和标准差必须要符合数学意义,不同实验应用，实验准备不同,比较不同样品中目的基因相对表达量,Slope0.1，使用比较CT值法 内参基因：数据均一化 数学公式：2 CT,不同实验应用，实验准备不同,检测未知样品基因型,荧光探针：两种不同标记，不用两种不同基因型检测 不同荧光表明基因型的不同,不同实验应用，实验准备不同,检测未知样品中某种成分的存在与否,IPC：阳性对照，检验反应体系工作与否 目的基因探针：荧光信号有无判断存在与否,实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材,实验应用方案：基本流程,目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对,GeneBank或者文献查找,实验应用方案,引物和探针设计,遵循引物设计的一般规则，特别是多重反应的应用 根据自身情况确定荧光探针的种类 遵循所选探针设计的一般规则 BLAST比对确认引物特异性,实验应用方案,荧光报告基因的选择,根据自身仪器的性能 根据自身实验条件 尽可能选择相对成熟的荧光报告基团：FAM，VIC等 选择高品质引物探针合成商,实验应用方案,标准品制备（标准曲线法）,新鲜标准品 遵循所有标准品制备原则,实验应用方案,退火温度 热启动 引物浓度 引物和探针的纯度 镁离子浓度 模板质量 模板浓度 UNG处理,实验应用方案,PCR反应体系优化,通常以315循环的荧光值作为阈值，也可以以阴性对照荧光值的最 高点作为基线 具体实验可以调整,实验应用方案,基线和阈值调节,软件给出标准曲线和未知样品中起始模板的量：绝对定量 通过得到的CT，套用现成公式进行定量：相对定量 根据软件荧光图谱，判断基因型或者存在/不存在,实验应用方案,数据分析,退火温度 热启动 引物浓度 引物和探针的纯度 镁离子浓度 模板质量 模板浓度 UNG处理,实验应用方案,PCR反应体系优化,退火温度 热启动 引物浓度 引物和探针的纯度 镁离子浓度 模板质量 模板浓度 UNG处理,实验应用方案,PCR反应体系优化,实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材,实验应用关键,标准品制备和标准曲线制作 重复样品 PCR反应体系的优化 荧光基团的正确选择,实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材,实验应用试剂耗材,