实验十三动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定.ppt

动物组织核酸的分离纯化及鉴定,1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验 3. 核酸的定量和纯度测定,核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,DNA和RNA的结构,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,1. 猪肝DNA和RNA的分离,核酸分离的原则 核酸存在于多种细胞，因此分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA的含量差异，各种分析方法对核酸的纯度及量的要求有差异，因此在实验前应对所采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。,核酸分离的一般步骤,1.溶解细胞 溶解细胞的方法因样品不同而不同。有的是用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）加NaOH，有的是用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法。 2有机溶剂抽提 利用苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实际上生物样品中含量最多的就是蛋白质。 3.纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。 4.沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用80%乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。 目前开发了许多商品化的核酸分离柱，试剂盒,可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA，其分离原理有的是利用核酸的分子量差异，有的是利用所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的目的。,DNA和RNA分离的基本原理,根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1mol/L的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。,酚：氯仿：异戊醇抽提,酚：有效的使蛋白质变性，不能完全的抑制RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH7.8，以防止DNA分配到有机相。结晶酚要在182度下重蒸去除醌类等氧化产物，这些物质能够引起磷酸二酯键的断裂或促进核酸交联。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。 氯仿：纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水。可以用氯仿将水相中的酚去除。 异戊醇：减少泡沫的产生。,实验步骤,2. 核糖和脱氧核糖的显色实验,加热条件下： D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色,DNA：1ml SC溶液溶解DNA，然后转移到50ml离心管中，用9ml 0.01M NaOH溶液溶解，4000rpm离心10分钟，上清转移到试管中备用。各取上述1mlDNA溶液于两个试管中，其中一个里面加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2ml二苯胺试剂，60 条件下反应1h，观察颜色反应。,RNA：将RNA沉淀用2ml蒸馏水溶解，然后转移至2只试管中，每只1ml。其中一只试管中加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2ml二苯胺试剂，60 条件下反应1h，观察颜色反应。,3. 核酸的定量和纯度测定,紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）,二苯胺显色法原理,DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成-羟基-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40400g范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。,实验方法,A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40-400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。 所用的DNA溶液为前面提取后溶解的DNA样品。,DNA标准曲线的制作和样品测定,注： 待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。,按上表加完各试剂后，充分混匀。于60水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。,DNA含量计算,DNA含量计算：以样品的光密度，根据标准曲线计算出相对应DNA