《基因表达干扰技术》PPT课件.ppt

1,基因表达干扰技术,2,基因表达干扰技术,二、核酶与脱氧核酶,三、小干扰RNA,四、微RNA,一、反义核酸技术,3,一、反义核酸技术,概念: 反义核酸:是根据碱基互补原理设计的,针对 特定靶序列互补的DNA或RNA片段，通过与特定靶序列结合，从而抑制特定基因的表达。,4,反义核酸技术:是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体内合成的特定互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术 种类：反义DNA 反义RNA 来源：人工合成 生物合成,5,（一）反义寡核苷酸(反义DNA)（ASON）技术 反义DNA:是人工合成的与待封闭基因的某一区段互补的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制或封闭这一基因的表达。,6,1.反义寡核苷酸的作用机制 (1) 抑制mRNA的翻译 (2) 抑制复制或转录 (3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达,7,降解 反义核酸 靶核酸 二聚体 空间阻碍,碱基互补,抑制基因表达,8,9,2.反义寡核苷酸的给药途径 （1）直接作用于培养细胞 （直接进入细胞） （2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞 （通过载体进入细胞） （3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、 肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径,10,（二）反义RNA技术,反义RNA 是指能和mRNA完全互补的小分子RNA片段，其与mRNA结合后可影响mRNA的正常修饰和翻译，从而调节基因表达。,11,1.反义RNA的作用机制 (1) 抑制DNA复制：与引物RNA结合，抑制复制 (2) 阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运 与mRNA互补结合影响加帽、剪接和加尾 (3) 抑制mRNA翻译 与5端SD序列、起始密码AUG结合，影响翻译 (4) 使mRNA更易被核酸酶识别而降解,12,2.反义RNA的设计 与ASON相比，反义RNA的设计较为简单 PCR反义基因+载体重组反义基因细胞反义RNA,13,（三）反义核酸技术的应用,1.基因分析 2.可作为探针进行原位杂交，分析基因表达 3.用于病毒病、肿瘤及遗传性疾病的治疗,14,二、核酶与脱氧核酶,（一）核酶 核酶是一类具有催化作用的RNA分子， 能够特异性地剪切底物RNA或突变的RNA。,15,1.核酶的分类 （1）大分子核酶： （2）小分子核酶 ：,16,2.核酶的结构 （1）锤头状核酶： 二级结构有三个 螺旋环结构区和 一个催化中心,17,（2）发夹形核酶： 每个结构域由 螺旋-环-螺旋组成,18,3.核酶的设计与修饰 设计：核酶核心与结合臂的设计 在底物RNA中选择最佳的剪切位点 修饰：防止被核酸酶降解,19,4.核酶转移方法 核酶需转入细胞内才能发挥功能 方法：外源性转移 内源性转移,20,5.核酶的应用 病毒性疾病的治疗 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 艾滋病毒 肿瘤的治疗,21,核酶的作用,22,（二）脱氧核酶 具有催化作用的DNA（人工合成）,23,1.脱氧核酶的结构种类及特征 （1）10-23型脱氧核酶：,24,（2）8-17型脱氧核酶：,25,2.脱氧核酶的催化特性 （1）RNA切割活性 （2）DNA连接酶活性 （3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性 （4）DNA切割活性 （5）N-糖基化酶活性 （6）DNA激酶活性 （7）DNA戴帽活性,26,3.脱氧核酶的应用 为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径,二、核酶与脱氧核酶,27,三、小干扰RNA,RNA干扰（RNAi）：利用特定的小分子单链 RNA与一条mRNA的互补区发生碱基 配对，从而阻遏这条mRNA的表达。 把这条小分子的RNA称为小干扰RNA（siRNA）,28,（一）一般研究路线,29,（二）RNAi的作用机制 1.起始阶段 2.效应阶段 3.倍增阶段,30,31,（三）siRNA的导入 1.脂质体或电穿孔 2.病毒携带 3.细胞穿透肽 （四）RNAi沉默效果的检测 检测mRNA或蛋白质,32,（五）RNAi的应用 1.基因功能的研究 2.基因剔除 3.基因治疗 4.细胞信号转导途径分析 5.药物开发,33,四、微RNA（miRNA）,是一组短小，一般为2024个核苷酸组成，本身不具有开放阅读框架，具有高度保守性、时序性和组织特异性的小分子RNA。,34,miR-#（#代表数字）表示miRNA mir-#（#代表数字）表示相应的编码基因,（一） miRNA的命名,35,（二）miRNA的作用机制 1.起始阶段：细胞内源性基因单链初级转录产物 2.成熟阶段：单链初级转录产物70核苷酸前体miRNA 胞质21核苷酸的miRNA 3.功能阶段：miRNA+蛋白质核糖核蛋白复合物,(Pri-miRNA),(Pre-miRNA),抑制mRNA翻译,调节基因表达,36,37,（三）siRNA与microRNA的区别 共同点 由22个左右的核苷酸组成 是Dicer酶的产物 需Argonate家族蛋白的存在 与RISC形成复合物起干扰、调节作用 可在转录后、翻译