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海洋微生物的研究进展,2014年4月29日,主要内容,一、海洋微生物的概述 二、未培养微生物的研究 三、海洋微生物培养的新方法 四、前景展望,概述,人类生存在一个被海洋覆盖的星球，海洋占地球表面的70%以上，海洋中的微生物包括细菌、真菌、放线菌及病毒等，提供了地球近一半的初级生产力，影响气候变化，参与物质和能量循环等。 海洋环境具有高盐、高压、低温、缺氧等特点，海洋微生物形成了有别于陆生生物的独特新陈代谢途径、生存繁殖方式、适应机制, 从而代谢产生结构独特的、具有多种生物活性的次级代谢产物。,概述,在过去的几时年间，从陆生微生物中发现新型生物活性物质（如新型抗生素）的速度越来越慢，人们越来越多的把目光集中在海洋微生物上（例如海洋放线菌、粘细菌等），希望从中发现新型生物活性分子。 海洋微生物来源的天然产物化合物具有高度的化学多样性(结构类型包括生物碱、聚酮、萜类、大环内脂、肽类、脂肪酸、酰胺等)和生物活性多样性(包括抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种活性)。,特性,与陆地相比，海洋环境以高盐、高压、低温和稀营养为特征。海洋微生物长期适应复杂的海洋环境而生存，因而有其独具的特性。 1.嗜盐性 2.嗜压性 3.嗜冷性,4.低营养性 5.趋化性与附着生长 6.多形性 7.发光性,特性,研究进展,海洋微生物包括可培养微生物和未可培养微生物, 对于可培养微生物的研究在很早就已经开展。然而海洋微生物中绝大多数还是未可培养微生物, 对于海洋未可培养微生物的研究才刚刚展开,如何快速大量地分离、培养和鉴定海洋生态系统中的微生物，成了深入研究海洋微生物及大规模从海洋微生物中筛选生物活性物质的瓶颈。,1、海洋微生物难培养的原因,基于16S rDNA序列分析的研究方法显示，海洋中的绝大多数微生物都未获得纯培养。Kogure等用直接活菌镜检计数法发现海水中90%以上的细菌都是活的，但是在培养基平板上却仅有少数的细菌（0.01-0.1%）能形成可见的菌落。大多数海洋微生物不能获得纯培养的原因可能是多方面的。,1、海洋微生物难培养的原因,1.1 实验室的纯培养破坏了微生物细胞之间的交流 许多海洋微生物与其他海洋生物/微生物处于共生状态，或其生长受周围其他海洋生物/微生物代谢产物以及一些其它生长因子的影响，离开原生态环境则难以生长。 例如：铁是所有微生物的一种必需元素，而实际上海水中的铁浓度非常低(0.4M )，并且只有极少数海洋细菌能够产生从环境中获取铁的铁载体（siderophores），这是一种小分子量铁螯合化合物。,1、海洋微生物难培养的原因,研究发现，当向含低浓度铁（含0.1 M Fe(III)）的培养基中加入外源的铁载体和C8-HSL(辛酰基高丝氨酸环内酯)时，原本在低浓度铁培养基上不能生长的海洋细菌也能形成菌落。这说明本身不能产生铁载体的海洋细菌在其他能产生铁载体的细菌存在的情况下也能从环境中获取铁，这是微生物之间的一种共生关系。,1、海洋微生物难培养的原因,另外，在饥饿状态下大多数微生物基因表达所涉及的cAMP、与大多数革兰氏阴性菌的密度感应系统(quorum sensing)密切相关的酰基高丝氨酸内酯(HSLs)分子等都可能是细胞之间沟通的信号分子。实验室对海洋微生物的纯培养破坏了微生物之间的这种共生状态，微生物之间的信息交流被阻断，生长必需的信号分子和生长因子缺乏，如许多海洋细菌离不开藻类分泌的生长因子和维生素，所以表现为不可培养。,1、海洋微生物难培养的原因,1.2 培养条件与原生态环境差别太大 由于自然界中微生物数量庞大，其可利用的营养物质极其匮乏，多数处于“寡营养”状态。常规的微生物培养基，其营养物浓度远远高于微生物生长的自然环境，高浓度的营养物质可能比较适合于那些生长速度快且对高浓度营养物质有抵抗能力的微生物，但是对那些生长速度较慢的微生物可能有抑制作用，甚至会出现底物加速死亡(Substrate accelerateddeath)现象。,1、海洋微生物难培养的原因,同时，实验室培养无法完全模拟海洋环境，而生存环境的巨大改变往往导致微生物不可培养。 (1) 在海洋中，微生物处于开放、流通的大环境，但在实验室培养时，微生物只能在恒温、恒湿的条件下生长。 (2)实验室传统的微生物培养方法是平板培养或液体震荡培养，这种培养方式与海洋微生物原始的生活环境差距太大，也会导致微生物的不生长。 (3)目前微生物的培养基只有有限的几种营养成分，不能提供微生物生长繁殖的一些必须的元素物质。,1、海洋微生物难培养的原因,1.3 氧化胁迫引起细胞损伤 当海洋中的微生物从自然环境突然转入人为环境时，一些对新环境适应能力较强或生长较快的微生物很快形成肉眼可见的菌落，这些生长快的微生物会产生大量过氧化物、自由基和超氧化物，这些物质的存在使那些适应能力较差或生长较慢的微生物细胞受到损伤，从而不能生长。,1、海洋微生物难培养的原因,1.4 生长缓慢的微生物被忽视 当把微生物从原始的生态环境中突然转入人为的环境时，适合生长的微生物占据优势地位,它们对营养成分的大量摄取使生长缓慢的微生物得不到充足的营养而生长受到限制。在培养基平板上，一个菌落中细胞的数目至少为105个才能用肉眼观察到，而那些生长速度较慢、其生长达不到高密度的细菌种类，在培养基上用肉眼是看不到菌落的，从而导致这些微生物的生长不被发觉，表现为“不可培养”。,1、海洋微生物难培养的原因,1.5 活的非可培养（VBNC）状态细菌的存在 细菌的VBNC状态，是指某些细菌处于不良环境条件下，其整个细胞常缩小成球形，用常规培养基在常规条件下培养时不能使其繁殖，但它们仍然具有代谢活性。这时细菌呈休眠状态，是细菌的一种特殊存活形式。,2、对未培养微生物的研究,由于上述的种种原因，大多数海洋微生物尚未被培养。目前，对不能进行纯培养的微生物的主要研究是依赖分子生物学手段，不需要对微生物进行培养，直接提取微生物基因组，通过基因组学、蛋白质组学等手段来了解未培养微生物的代谢途径、基因表达的调控机制等信息。,基于16S rDNA基因分析的方法在研究环境中的分类单元和物种时起了很大的作用。但所能提供的信息量也是很有限的。近年来发展起来的宏基因组学，利用分子生物学的研究方法绕过纯培养技术来研究微生物的多样性及功能，提供了一种探知微生物多样性结构和功能基因组的免培方法，是一条寻找新基因及其产物的新途径。,宏基因组技术在开发未 培养微生物中的应用,1998年，ARIDA Pharmaceuticals公司的科学家Handelsman等首次提出宏基因组(the genomes of the total micro biota found in nature)的概念。宏基因组是指某一特定的环境中全部微生物（可培养的和未培养）基因的总和。 宏基因组学( metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法，也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。,宏基因组学技术流程,1、从环境中提取宏基因组DNA； 2、用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片段并连接到合适的载体上； 3、转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库； 4、宏基因组文库筛选。,一、环境样品DNA提取,提取步骤通常需要满足两个条件： 尽可能提取样品所有微生物的基因， 保持片段的完整和纯度。,一、环境样品DNA提取,样品提取方法 物理法：冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法 化学法：常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等 酶裂解法 依据提取样品总DNA前是否分离细胞，又可以分为原位裂解法和异位裂解法。,一、环境样品DNA提取,1、原位裂解法（直接提取法） 原位裂解法是在环境样品中加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解然后从样品中直接提取DNA并纯化的方法。 优缺点：该法提取的DNA产量较高，操作容易、成本低，但纯度低，腐植酸等污染严重，往往还需要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作的需要，此外，由于机械剪切作用较强，提得的DNA片段长度有限（1-50Kb），常适用于构建小片段插人文库(以质粒和噬菌体为载体)的DNA提取。,一、环境样品DNA提取,2、异位裂解法 异位裂解法是先把微生物细胞从环境样品中分离出来，再从微生物细胞提取DNA并纯化。 优缺点：所得的DNA纯度较高，但DNA产量及所包含的基因组信息的广泛性不及直接提取法并且操作繁琐、成本高、得率低。间接提取法提得的DNA片段长度相对较长（20-500Kb），适合构建黏粒（cosmid）文库和细菌人工染色体（BAC）文库。,二、宏基因组文库构建,1、载体系统选择 常用的克隆载体有: 质粒载体(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10 kb； Cosmid(黏粒载体，如pWE15)，插入片段3045kb； BAC(细菌人工染色体，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。,1、选择合适的载体系统，应考虑以下因素 : 所提DNA的质量及研究目的，包括插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。 如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子。而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则适宜构建Cosmid、Fosmid或BAC文库，从而筛选由较大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征环境中未培养微生物基因组的较大基因片段。,二、宏基因组文库构建,二、宏基因组文库构建,2、宿主系统选择 宿主菌株的选择主要考虑： 转化效率，重组载体在宿主细胞中的稳定性，宿主能否为相关功能基因提供必需的转录表达体系，对异源表达基因产物提供必需的转录表达体系，对异源表达基因产物是否有较强的相容性，以及目标性状(如抗菌性)及缺陷型等因素。 研究表明，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。鉴于7O% 的抗生素来源于放线菌的事实，若以寻找抗菌、抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想；而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。,二、宏基因组文库构建,3、转化 在宏基因组克隆中，所谓转化是指通过适当的方法使宿主细胞处于感受态，从而摄取重组DNA的水平方向的基因转移过程。 其方法有CaC12法和电穿孔法。 CaC12法即用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为能摄取外源DNA 的感受状态，该方法自建立以来已广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒的转化，但该方法转化效率不高。 电穿孔法是用高压脉冲电流击破宿主细胞膜或击成小孔，从而使外源DNA由小孔进入细胞，转化效率较高。,三、宏基因组文库筛选,1、 功能驱动的筛选 2、 化合物结构水平的筛选 3、 序列驱动的筛选 4、 底物诱导的筛选,1 功能驱动的筛选 功能驱动的筛选(Function-driven screening)即基于活性的筛选。 是根据重组克隆产生的新活性而进行筛选的方法。 优点：只要基因能在宿主中表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，能迅速找到可用于工农业和医药业的酶等蛋白质和抗生素等天然产物； 缺点：目的基因必须能在宿主中进行功能表达，而基因表达与否除了和宿主有关外，还决定于基因本身的完整性，这就要求一方面要选择合适的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中基因的某个组件遭到破坏将使基因无法表达，也就不能根据表型加以筛选。筛选工作量大、效率低。,2 化合物结构水平的筛选 化合物结构水平的筛选(Screening on compound structure)是根据不同结构的物质在色谱中有不同的吸收峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图，筛选产生新结构化合物的克隆子。 这一方法可直接筛选到新结构化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。,3 序列驱动的筛选 序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列的克隆子。 优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。 缺点：必须对相关基因序列有所了解，无法筛选宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同的新基因(即未知基因)。,通过基因芯片技术寻找环境基因组序列中的有用片段也是一种全新的筛选技术，它可以快速有效的识别和描述许多菌落的特征，并可应用于大量保守基因的分离。基于序列的筛选策略可以利用基因芯片技术大大提高筛选效率，有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，但必须对相关基因序列有一定的了解，较难发现全新的活性物质。,4 底物诱导的筛选 底物诱导的筛选(Substrate-induced gene expression screening，SIGEX)是利用合适的底物进行诱导，使克隆子分解代谢基因表达来进行筛选的方法。 优点：为高通量筛选提供了保障，而且不需要对底物进行修饰；可以从底物推断出未知的酶，进而推断基因的功能;,缺点：对目标基因的结构性和适应性很敏感，用于诱导的底物必须要进入细胞质，若不能进入细胞质，则无法诱导目的基因的表达；但是某些基因的表达不仅受底物诱导，还可受其他因子的诱导；某些基因无需诱导即能表达；某些本可诱导表达的基因由于宿主的改变而无法诱导表达。而且对进样设备的要求也比较高。,尽管应用分子生物学和非培养手段分析环境中的海洋微生物基因组能够获得大量的信息，避免了传统微生物培养的一些局限性，但是要了解基因组中某些基因表达产物的代谢途径，对海洋细菌的一些深入的生理学研究以及相关的生物技术的发展还将有赖于微生物的培养与纯化。,另外，人口数量的增加、渔业的过度开发、气候变化和环境污染等因素，也使自然界中的很多微生物种类逐渐消失，对环境中微生物进行培养、纯化并保种，建立微生物菌种库，可以使大量的微生物资源得以保存，对于微生物资源的保护、利用和研究开发具有非常重大的意义。,近年发展的海洋微生物培养新方法,海洋微生物学家越来越认识到，经典的平板培养方法不适合于海洋微生物的培养。近年来，一些研究者开始尝试新的培养方法来增加可培养细菌的种类，这些新方法多采用稀释的培养基或模拟自然环境直接用无菌海水进行培养。,3.1 向培养基中添加微生物生长所必需的成分 在培养基中加入微生物相互作用的信号分子(酰基高丝氨酸内酯、cAMP或ATP等)就可简单地模拟微生物间的相互作用,满足微生物生长繁殖的要求。 其中与革兰氏阴性菌多种基因调控有关的cAMP是最有效的信号分子，10 M cAMP可使10%的微生物细胞（用显微镜直接计数法计算微生物细胞的总数）培养出来。然而，用加有cAMP的培养基培养出来的细菌如果不继续添加信号分子，则不能生长。Kashefi 等根据嗜高热微生物利用Fe(III)作为终端电子受体这一高度保守的特性, 在培养基中添加非常微量的Fe(III)氧化物,能提高嗜高热微生物的可培养性。,3.2 降低培养过程中的毒害作用 为了降低培养过程中优势菌种代谢所产生的过氧化物、自由基和一些拮抗物质的毒害作用，可以在培养基中添加对这些毒性成分具有降解能力的物质，如丙酮酸钠、甜菜碱、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶等。SOD 和丙酮酸钠的代谢产物 NADH、H+可与超氧化物结合，从而降低了超氧化物对细胞的损害作用。甜菜碱（三甲氨基乙内酯）的三个甲基中有两个可以被超氧化物或自由基氧化，也可以降低超氧化物或自由基对细胞的毒害作用。过氧化氢酶通过对过氧化物的水解，减少了过氧化物对微生物的毒害作用。同时,充足的氧气有时也是毒性氧产生的原因之一,减少培养环境中的氧分压也可减弱毒性氧的影响。,3.3 稀释培养法 海洋微生物目前获得纯培养的不到1%，这是由于海洋环境中主要是寡营养微生物，而在实验室培养时，培养基的营养物浓度远远高于微生物生长的自然环境。高浓度的营养可能对寡营养微生物具有抑制作用。,1993年，Button等提出一个崭新的方法，即稀释培养法（Dilution culture），来解决这个问题。Button等先将海洋微生物群落计数后再进行稀释，然后接种于灭菌海水中进行培养。培养九周后用流式细胞仪检测，发现微生物细胞的浓度可达到104个/ml，细胞的倍增时间为一天到一周。 传统的培养方法中营养物质的添加刺激了某些微生物的生长，但是却抑制了大多数微生物的生长。Schut等应用稀释培养法在实验室环境下也培养出了典型海洋细菌。将常规微生物培养基进行稀释，使营养物浓度降低，也能增加可培养微生物的数量。,3.4 高通量培养法 2002年，Connon等提出了高通量培养法（High-throughput culturing）。他们将样品浓度稀释至103个/ml后，采用48孔细胞培养板分离培养微生物。通过这种方法可培养出高于传统微生物培养技术所培养的微生物数量。,3.5 扩散盒培养法 这种培养方法是模拟海洋微生物生长的自然环境。Kaeberlein 等设计了一种培养装置名为扩散盒（diffusion chamber）。该扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的 0.1 m 滤膜组成。将海洋微生物样品加至封闭的扩散盒中，在模拟采样点环境条件的玻璃缸中进行培养。扩散盒的膜可使化学物质在盒内和环境之间进行交换，但是细胞却不能自由移动。这种培养方法能较大程度地模拟微生物所处的自然环境，由于化学物质可以自由穿过薄膜，可保证微生物群落间作用的存在，从而提高了微生物的可培养性。,3.6 微囊包埋法 微囊包埋法是海洋微生物的另一种高通量分离培养技术。先将海水和土壤样品中的微生物进行稀释培养，然后将稀释到一定浓度的菌液与融化的琼脂糖混合，制成包埋单个微生物细胞的琼脂糖微囊，然后将微囊装入凝胶柱内，用培养液进行流动培养。凝胶柱进口端用0.1m滤膜封住，防止细菌的进入而污染凝胶柱；出口端用8m滤膜封住，防止微囊随培养液流出。 该技术将琼脂糖包埋培养与流式细胞仪筛选结合起来，这样就可以增加细胞检测的灵敏度，缩短低生长率细胞的培养时间。,该技术的主要优点是： 尽管每个细胞被单独包埋，但是来自环境的所有被包埋的细胞都在一起培养，这在一定程度上模拟了自然环境，而且由于微囊的孔径较大，代谢产物和一些其他分子(如信号分子)可以互相交换，这些由其他微生物产生的可以扩散的分子可以增加微生物的可培养性。 微囊是在一个开放的、连续补充营养的系统中，而不是在一个封闭的系统中，这也模拟了大多数自然环境的开放条件。,这种培养方法不仅能够高通量的分离和培养微生物，而且能够很容易的进行下游的扩大培养。长出的微菌落可用于接种，进行扩大培养。 该分离培养技术可使大量的微生物获得纯培养。,3.7 针对放线菌的培养法 Gavrish等根据放线菌独特的长菌丝以及能穿透固体培养基的特性提出了一种专门筛选放线菌的新方法。 将两片具有半透性的膜分别上下封在中间装有灭菌琼脂的塑料容器上，下层膜的孔径是0.2-0.6m,上层膜的孔径是0.03m，将装置置于土壤中，细丝状的微生物就会选择性的刺入装置并长成菌落。将下层膜的孔径减少至0.2m就能限制真菌菌丝的刺