NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探.doc

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探 作者：赵丽君 刘燕翔 刘珍 王伯瑶 黄宁 吴琦【摘要】 目的：构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作，采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp)，插入质粒pGL3basic载体，构建重组质粒pGL3NOX4，重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3NOX4转染A549细胞，通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。 【关键词】 NOX4;报告基因;表达调控还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶首先发现于中性粒细胞和单核/巨噬细胞，在吞噬微生物病原体时，NADPH氧化酶被激活，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，成为机体抵抗微生物感染的重要成分1。近年，在非吞噬细胞质膜上发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPH oxidase)蛋白家族。人类基因组同源性检索发现了7种NADPH氧化酶，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox22-4。NOX家族广泛表达于机体的组织器官，它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反应中的作用，我们构建NOX4报告基因重组质粒pGL3NOX4，并初步观察了炎症细胞因子对该基因表达水平的影响。1 主要材料和试剂A549上皮细胞株、E.coli DH5为本实验室保存。荧光素酶报告基因载体pGL3basic，海肾荧光素酶内对照报告载体pRLTK及DualLuciferase Report Assay System为Promega产品。质粒提取，PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega公司。DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，细胞因子TNF、IFN购自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP,限制性内切酶(Xho1，BamH)，T4DNA连接酶等购自Takara公司。基因组DNA提取试剂盒，DL2000 DNA Marker购自天根生物技术有限公司。2 方法2.1 质粒载体的构建2.1.1 引物合成 通过GenBank检索NOX4基因全序列，参考相关文献，设计扩增出含有NFB结合位点的NOX4基因上游调控序列。引物设计采用Primer5.0软件，其序列如下：P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAGP2：GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA引物分别含限制性内切酶Xho1，BamH酶切位点，扩增片段全长533bp。引物由大连宝生物技术有限公司合成。2.1.2 PCR 以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为25L，含10PCR反应buffer2.5L; dNTP 2L;上下游引物各0.5L;Pfu高保真酶0.2L;DNA模板0.5L;其余加水补足。反应条件为94变性3min，之后进行30个循环(94 30s，.51 30s，72 4min,，)，72延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物做电泳胶回收。pGL3basic载体用Xho1，BamH双酶切，小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒载体。2.1.3 重组质粒的构建 经酶切纯化后的PCR产物和pGL3basic载体用T4DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5感受态细菌中，涂布于LB培养板，37孵育过夜，挑取细菌克隆提质粒，用Xho1，BamH进行双酶切鉴定，最后经ABI 3730全自动DNA测序仪进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。2.2 细胞转染及报告基因活性检测2.2.1 细胞转染 用含10%新生小牛血清的DMEM培养基培养A549细胞。将对数生长期的细胞于转染前24小时，按每孔10104个细胞密度接种于48孔培养板，当细胞达85-95%时，按照Lipofectamine 2000说明书进行重组质粒pGL3basicNOX4和pRLTK载体转染。具体操作为将细胞培养基换为无血清的DMEM( 100L/孔)，Lipofectamine 2000与质粒DNA(报告基因重组质粒和内对照质粒pRLTK)以一定比例各加入100L无血清的DMEM中，5min后混合，室温孵育20min，再加入细胞培养孔，37，5%CO2的孵箱中培养24-48h。2.2.2 细胞因子刺激试验 实验分组为TNF组，IFN组，TNF+IFN组，空白对照组。TNF终浓度为25ngmL-1，IFN终浓度为10ngmL-1，在细胞因子刺激A549细胞的不同时间点(6h，12h，24h)，裂解细胞检测NOX4报告基因表达水平。实验均设3复孔。2.2.3 报告基因活性检测 在细胞因子刺激细胞后的不时间点吸去培养基，PBS洗涤细胞。每孔加入60L的1PLB细胞裂解液(按DualLuciferase Report Assay System试剂盒说明配备)，孵育30min，收集裂解液，10000转4离心10min，上请储存于-20备用。取20L细胞裂解上请，根据DualLuciferase Report Assay System试剂盒说明进行报告基因萤火虫荧光素酶及内对照海肾荧光素酶检测，仪器采用Beckman Coulter DTX880。实验数据采用SPSS软件进行分析，采用T检验。3 结果3.1 报告基因重组质粒(pGL3NOX4)的构建和鉴定以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。产物于1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果在约533bp处可以见到与预期大小相符的目的片段(图1)。PCR产物插入pGL3basic载体，得到重组质粒pGL3NOX4经Xho，BamH双酶切鉴定，显示有一条为约533bp片段(图2)，通过上海英俊生物公司测序证实，重组质粒目的片段与Genbank报道序列一致。3.2 细胞因子刺激A549细胞报告基因活性检测用细胞因子TNF，IFN刺激转染了报告基因pGL3NOX4的A549细胞，分别于刺激6、12、24小时裂解细胞测定荧光素酶活性。结果显示单独采用TNF或IFN都能够刺激报告基因的表达，而联合使用两种细胞因子的刺激作用更强。在刺激6、12、24小时，两种细胞因子刺激实验组荧光素酶活性分别为未加细胞因子的阴性对照组(DMEM对照)荧光素酶活性的2.6、2.2、2.0倍。实验数值经SPSS软件分析，各实验组与对照组相比，P<0.05(图3)4 讨论表达于中性粒细胞和单核/巨噬细胞的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶最先被发现，该酶是吞噬细胞呼吸爆发的关键分子，吞噬细胞通过呼吸爆发产生大量活性氧(ROS)，成为依赖氧杀菌机制的重要介质1。吞噬细胞NADPH氧化酶的催化亚基gp91 phox位于细胞质膜，当细胞受刺激后，gp91phox与胞浆中其他亚基(p22phox，p47phox，p40phox，p67phox,和Rac)共同形成有活性的NADPH氧化酶复合体。吞噬细胞gp91 phox现在称为NOX2。与gp91 phox结构同源的分子共同组成NOX蛋白家族，他们包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5，Duox1和Duox2。他们与NOX2一样均参与细胞ROS生成，所不同的是，NOX2似特异表达于吞噬细胞，而NOX蛋白家族其他成员在组织细胞有广泛表达，由于他们发现较晚，其生理功能研究有待深入2-3。活性氧往往作为第二信使参与细胞信号转导，在MAPKs信号通路、JAKSTAT信号通路、NFB信号通路等，都有活性氧参与其中，这些信号传导与细胞分裂分化，转化，迁移，凋亡等过程密切相关，由此也提示NOX蛋白家族与上述重要生命现象关联4-6。最初研究表明，NOX4在肾脏组织中大量的表达，它可能作为一种敏感性氧感受器，NOX4主要分布在鼠肾的近端小管和人肾单位远端，而促红细胞生成素(EPO)的生成与管周细胞相邻。在肝脏也表达少量NOX4的mRNA，提示N0X4可能作为EPO合成的氧感受器7-8。最近有研究发现，NOX4在中枢神经系统的神经元中也有一定表达。除了NOX2，NOX家族其他分子在机体天然免疫及炎症中的作用仍有待研究9-10。本实验构建了NOX4荧光素酶报告基因重组质粒，成功转染A549细胞，以此为模型，观察炎症细胞因子对NOX4表达的影响，结果发现TNF、IFN刺激NOX4基因表达，这不但提示NOX4参与细胞炎症反应，同时为我们进一步探讨NOX家族在机体对抗微生物感染过程中的作用奠定了很好的基础。【参考文献】 1 Clark RA. Activation of the neutrophil respiratory burst oxidaseJ. J Infect Dis, 1999, 179(Suppl 2): S309-S317.2Kikuchi H, Hikage M, Miyashita H, et a1. NADPH oxidase subunit, gp91(phox) homologue, preferentially expressed in human colon epithelial cellsJ. Gene, 2000, 254(1，2): 237-243.3Cheng GJ, Cao ZH, Xu XX, et a1.Homologs of gp91phox: cloning and tissue expression of NOX3, NOX4, and NOX5J. Gene, 2001, 269(1):131-140.4Clempus RE, Griendling KK. Reactive oxygen species signaling in vascular smooth muscle cellsJ. Cardiovasc Res, 2006, 71(1): 216-225.5Gu Y, Xu YC, Wu RF, et al. TNFalpha activates cJun amino terminal kinase through p47(Phox) J. Exp Cell Res, 2002, 272(1): 62-74.6Madamanchi NR, Li S, Patterson C, et al. Reactive oxygen species regulate heatshock protein70 via the JAK/STAT pathwayJ. Arterioscler ThrombVasc Biol, 2001, 21(2): 321-326.7GeisztM, Kopp J B, Vamal P, et a1.Identification of Renox, an NAD(P)H oxidase in kidneyJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(15):8010-8014.8Shiose A, Kuroda J, Tsuruya K, et a1. A novel superoxideproducing NAD(P)H oxidase in kidneyJ. J Bi