中医证候本质研究现状及引入系统生物学技术新趋势.doc

中医证候本质研究现状及引入系统生物学技术新趋势【关键词】 中医证候；基因组学；蛋白质组学；代谢组学；系统生物学；综述中医证候研究一直是中医基础领域的重要内容,也是当前国家自然科学基金委中医药学科重点资助的方向之一。2006年,国家自然科学基金委曾确定“证候与疾病和方剂的相关性理论是中医基础理论建立的最根本问题,并列为中医药重大研究计划”,充分说明了证候研究在中医药现代化中的重要性。自从20世纪60年代初肾本质的研究开展以来,证候研究大体经历过几个发展的高峰时期,70年代后期的证候动物模型研究、80年代中期的证候微观指标客观化研究,以及21世纪初的病证方的物质基础纵深研究。纵观证候近半个世纪的研究成果,如肾虚证、血瘀证等本质的研究在中医现代化研究史上具有里程碑意义,为其他证候研究起到示范性作用。但是,随着实验技术的飞速发展及证候研究的不断深入,一些学术问题也日益暴露。笔者现拟从证候模型的总体现状、证候的现代概念、现代系统生物学技术在证候本质研究中的现状及发展趋势进行梳理,在此略陈管见,与学术界同道商榷。1 证候动物模型研究现状及建议 证候动物模型的研究源于20世纪60年代,经过近半个世纪的努力探索、研究与积累,硕果累累。据统计,目前证候模型多达200余种,给中医药现代化的研究奠定了一定的基础,也是中医走向现代化的第一次突破,在中医现代化史上具有里程碑的意义。然而,回顾证候模型的复制方法,大体上是依据以下2条原则进行造模：依据中医理论病因病机学说造模,如限制饮食法复制气虚证模型、放血法复制气血两虚证模型、寒冷环境下复制实寒证模型等；依据中药或西药的药理作用造模,如大黄或番泻叶复制的脾虚证模型、右旋糖苷复制的血瘀证模型、氢化可的松复制的肾阳虚证模型等。以上模型似乎符合中医“病因-病机-证候”学说形成机制,但笔者不完全赞同以上单一线性的因果证候模型形成机制。理由是：模型的载体即动物存在个体差异,因为哪怕是近交系甚至是同卵双胞胎也存在个体差异,因而相同的致病因素作用于不同体质的个体动物上,其产生的效应是不一致的,即证候表现不一致。因此,笔者认为,“通常认为采用某一或若干因素干预动物后形成某某证候”这种说法不妥。既然如此,动物的证候又如何来确定呢？笔者认为,这涉及到再辨证问题,即同一造模因素复制的证候模型需要再辨证！回顾临床,我们可以深刻地体会到,在同一环境下感受相同寒邪后,不同机体会出现风热证或风寒证,表实证或表虚证；同样,在同类型肿瘤不同患者中,接受同一化疗方案后,个体表现的证候是不一致的,有脾气虚、肾阴虚,还有脾胃不和、阴阳两虚等差异；此外,不同动物对相同刺激可有不同的反应,不同品系及其亚系动物对同一药物反应也有差异。因此,笔者认为,目前证候模型的研究中最需学术界关心的是造模后再辨证的问题,而不是停留在造模因素上的分歧,也不必强调一定要在中医基础理论指导下造模。既然提出要对动物实施中医辨证,就必须建立实验动物的证候采集标准、辨证标准。目前,这方面工作国内开展不多。上海中医药大学国家中医药管理局中医基础理论重点学科方肇勤教授课题组从1999年开始探索,历经近10年的艰苦探索与反复研究,取得了一定的成绩,先后建立起了“小鼠四诊工作站构建与操作标准”、“小鼠四诊采集项目标准”、“小鼠常见证候的辨证标准”、“大鼠/小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价”,并编著辨证论治实验方法学实验小鼠诊法和辨证专著1-5。但我们深知这仅仅是起步,许多内容尚需深入挖掘与研究。关于实验动物中医辨证研究,国内部分学者也认识到这一问题的重要性,如宋氏6认为,对证候本质的研究必须从动物证候学入手,研发相关的技术,制定相应的评价标准,对现有的疾病模型动物进行中医辨证。我们希望学术界同仁对此一起探索,以推动证候模型的进一步发展。2 证候的现代概念近年来,随着国家对中医现代化研究投入力度的加大,证候病机的物质基础研究热浪滚滚,由此以来,证候概念的现代内涵也蕴育而生,如沈氏7把“证”定义为“是一种综合性功能态,有具体的功能网络和调控中心”。申氏8认为,证是属于现代医学理论中的病理生理过程和临床综合征。王氏9认为,证是有其本质的,辨证是有一定分子生物学的基础,论治是有针对性地调整某些基因或一组基因,及其功能的表达状态。王氏10认为,中医证本质极为复杂,是一种多基因参与和调控的,具有时空性、系统性及层次性的临床症候群。张氏等11把“证”描述为“是中医关于人体在疾病状态下信息的综合征象；是对人体在疾病发生、发展过程中某一时段性生理、病理的概括；是中医学辨证论治的主体”。宋氏6认为,证候是通过四诊手段获取的机体在某一时空条件下对各种内外因素(包括机体生理功能及生物、化学、环境、精神、气候等各种致病因子)的整体性反应而呈现的生理、病理信息的综合判断结果的表述。证候也可简称反应态,且具有整体性、时空性、传变性和个体差异性等特点。王氏12提出,任何一种证候都是由若干证候要素和证候要素靶位组成,其中证候要素是对证候病因病机的表述,证候要素靶位是关于证候要素发生部位的厘定。并认为,任一证候要素或证候要素靶位都具有不同于其他证候要素或证候要素靶位的特异性症状、体征及其组合。罗氏等13基于证候代谢组学的研究,提出“证是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态,其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群,其本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变”。以上证候概念的现代化语言表述,是建立在国内许多知名学者对证候实验研究基础之上,它以实验数据来支撑。尽管未能达成一致见解,但这恰好说明了证候研究处于蓬勃发展时期,导致不同学者在已有研究成果上赋予证候不同的内涵,呈现一派百家争鸣的学术气氛。同时,体现了学术界认识到证候的发生有其客观的物质基础,采用现代医学技术可以挖掘出证候的本质。然而,证候病机的物质基础,即其分子指标有无特异性？一个证候是否就是由某一特定的分子决定,还是由一群相关联的各种生物标志物共同构成的呢？笔者认为,采用现代系统生物学技术,如高通量的基因芯片、蛋白质芯片等筛选方法可以得到较为客观、翔实的答案。3 现代系统生物学技术在证候本质研究中的近况在证候本质的实验研究上,以往学术界对证候的微观指标进行了不懈的探索。早期研究最多的是生化指标,比如脾虚模型观测指标就多达70项,其中比较公认的有酸刺激后唾液淀粉酶活性下降和木糖吸收率下降两项,但临床实际意义不大。以后过渡到目标基因的检测,如吴氏等14研究发现p53、Bcl-2蛋白是结肠癌脾虚证的相关基因。胡氏等15发现,从脾胃气阴两虚兼气滞到兼胃热再到兼血瘀,p21ras、c-erbB-2、p53癌基因的表达逐渐增加。既往的这些微观指标研究总体而言呈现主观、分散、非特异性等特征,不能全面、客观、真实地反映证候的本质。因而,目前需要借助于高通量的基因组学、蛋白质组学、代谢组学等系统生物学技术来研究,这为中医证候本质的研究提供了新的技术平台。3.1 基因组学技术在证候研究中的运用基因组学由美国科学家Thomas Roderick于1986年提出,是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱和转录本图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学,基因组学可分为结构基因组学、比较基因组学和功能基因组学。目前,研究最广泛的是功能基因组学。基因组学能否用于中医证候本质的研究？站在科学最前沿的科学家总是看得最清楚的。在基因芯片技术刚引入国内时,杨氏16就认为,要使西医的病与中医的证统一起来,基因表达谱也许将是重要的连结点。宋氏等17认为,以基因组学作为中医现代化切入点的时机已经成熟,基因组学正是中医药现代化的最佳切入点。沈氏18认为,遵循中医学研究本身的内在规律,充分利用功能基因组学的研究成果,建立中医证的表达谱,将是21世纪中医药学的主要发展趋势。方氏19认为,在疾病模型基础上通过辨证,再对主要的病变组织利用基因芯片技术检测,可以了解证与证、证与病、证与体质之间的差异,并揭示证和辨证论治在基因水平上的机制与因果关系。尽管目前这方面的具体研究成果不多,但已开拓了我们的视野。王氏20采用基因芯片技术对人类证候进行了研究,并获得了一批差异基因表达数据,如用18000个点的基因芯片从肾阳虚证患者和正常人的比照研究之中筛选出差异表达基因1950条；用基因芯片技术对同一家系中虚寒证患者和正常人进行基因表达谱检测,发现此虚寒证家系中虚寒证患者与能量等代谢相关的差异表达基因达15个。高氏等21检测糖尿病家系中肾阴阳两虚血瘀证糖尿病患者与同家系中正常人,发现差异基因446条,其中包括与代谢、细胞凋亡、细胞周期、糖尿病相关基因和与传统中医理论肾的功能、血瘀相关基因。王氏等22应用基因芯片技术研究证实,脾虚证实质涉及大脑皮层和海马的基因表达谱改变,但与大脑皮质比较海马的基因表达改变少。盛氏等23观察了DEN诱发大鼠肝癌过程中,不同时期与不同治法对肝脏基因芯片表达特征,发现在芯片的15710个基因中,正常组有9225个基因表达,诱癌4周表达增至9396个,8周增至9872个,16周增至10496个,20周有10420个。此外,潘氏等24进一步对不同证候的H22肝癌荷瘤小鼠进行了外显子芯片检测,发现不同证候小鼠肾上腺等组织有大量的独特差异表达基因,如筛选阳气虚证独特上调基因52条、独特下调基因11条；气阴阳虚证独特上调和下调基因分别为23条和4条。以上芯片结果获得部分差异基因,但目前对这些差异基因的比较、分析、验证、重复等后续报道较少。笔者认为,考虑到基因芯片数据海量,研究者重点关注的是不同证候特征性差异表达基因,基于不同证候与正常的比值差异及基因的相对表达量(芯片读数计算值)这2个基本条件,去筛选证候形成的主效应基因,然后开展后续的验证研究才是基因组学技术在证候本质研究中的价值所在,对阐明证候的物质基础才具有真实的学术意义。3.2 蛋白质组学技术在证候研究中的运用蛋白质组最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams于1994年首先提出的。蛋白质组是指一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分,它研究不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体,以揭示生命活动的基本规律。蛋白质组学技术能否应用于中医证候本质的研究呢？余氏等25-26分别从认知和技术的可行性分析,认为蛋白质组学与中医辨证论治的认识方法相似,是从整体的角度出发,分析细胞内所有动态变化的蛋白质组分、表达水平与修饰状态,是从基因层面向蛋白质层面的深化,有利于动态地揭示同一个研究对象不同时期的变动性,更符合证候的特点。目前,蛋白质组学技术在中医证候研究是一个新的热点。例如,马氏等27-28用蛋白质组学技术研究四物汤对60Co 射线造成血虚证小鼠血清蛋白和骨髓蛋白的影响,发现四物汤可使血虚证小鼠血清中12个下调的蛋白点和4个上调的蛋白点有所恢复,可逆转血虚证小鼠骨髓10个上调和5个下调的蛋白质。梁氏等29研究肾阳虚证小鼠,发现了肾脏中大量有代表意义的差异蛋白质点。卢氏等30对肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组研究表明,肾阳虚动物能量代谢相关酶的变化与肾阳虚的临床虚寒症状有关。谢氏等31对脂多糖致热毒血瘀证大鼠的血清进行了二维电泳分离分析,发现有13个蛋白点出现非常明显的含量变化。张氏等32对高血压肝阳上亢大鼠模型脾的单个核细胞的蛋白质组进行了分析,结果在高血压肝阳上亢大鼠中检测到497个点,其中为其独自所有的点有387个,并认为可能与高血压肝阳上亢证候相关。谭氏等33采用蛋白质组学技术研究抑郁症、经前期综合征、更年期综合征3种疾病肝郁证血清指标,结果发现了12个差异蛋白质点及其与疾病的关系。尽管以上不同证候与有关蛋白质的关系被初步发现与阐明,但这些蛋白质能否代表证候的特征、是否具有特异性、重复性又如何等诸多问题尚不能定论,因而笔者建议,学术界对这些蛋白质与证候关系的后续深入研究是重点,以获得可信、稳定、真实的证候物质基础。3.3 代谢组学技术在证候研究中的运用代谢组学是英国Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的,它是在机体新陈代谢的动态过程中,系统研究一个细胞、组织或器官所有代谢组分,尤其是分子质量为1000以下小分子的变化规律,以揭示机体生命活动的代谢本质。代谢组学研究的样品通常为血液、尿液等,通过检测其代谢组分以了解体内的异常代谢状态,因而具有整体性、终端性及动态性等特征。目前,代谢组学技术主要用于现代医学及中药现代研究中,如在肿瘤机制研究、冠心病诊断、药物对肝毒性研究等方面的应用；此外,在实验动物模型的评价及外源物产生的一系列代谢过程、作用机制、靶器官的效应、组织损伤等研究中也被应用34。代谢组学作为一门新发展的技术,同基因组学和蛋白质组学一样,属于系统生物学的重要组成部分,它能否应用于中医证候本质的研究？王氏等35认为,代谢组学对证候模型的评价起到客观化作用,通过建立动物体液的“代谢指纹图谱”,在主成分分析法基础上,比较证候模型动物的体液代谢图谱,分析代谢模式差异性,有可能寻找到代谢网络缺陷的重要生物标志。相比基因组学和蛋白组学而言,目前,代谢组学技术在中医证候研究案例较少。罗氏等36报道,采用超导傅立叶变化核磁共振波谱仪检测肝郁脾虚模型大鼠血浆,对其代谢物组的共性分析和生物标记物进行主成分分析,结果发现,各组动物代谢谱各不相同,肝郁脾虚证大鼠血浆醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和部分未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。贾氏等37采用代谢组学研究肾阳虚模型动物,发现其代谢网络明显偏离正常动物,经温阳中药干预后,肾阳虚动物的代谢谱回归至正常范围,呈现网络修复的结果。总之,现代系统生物学理论与技术在中医证候本质研究中已被运用,其中基因组学与蛋白质组学技术在证候研究中运用最广泛,可能与基因芯片等技术的成熟、稳定等有关,而代谢组学在证候研究中相对较少。由于基因组学和蛋白质组学研究分别在基因转录和蛋白质层面揭示可能发生的事件,更具有动态的特征,而代谢组学则反映确实已经发生了的事情,突出机体整体性与终端特征。因而笔者建议,在证候本质的研究中,将这3种“组学”技术联合运用,将对证候本质的阐明具有十分重要的学术意义。4 展望中医证候本质的研究是一项长期、艰巨又重大的关键科学问题。纵观以往中医药工作者的研究积累,我们可以清楚地看出,不少中医药工作者已提出了系统生物学技术在证候研究中的思路38-41,业已开展了证候本质的探索。但目前尚处于研究的前期阶段,重复且可靠的证候物质基础尚未发现,一些报道与证候有关的散在分子指标可能尚具有组织特异性。那么,如何全面揭示证候的客观本质呢？从中医学的整体观、辨证论治思维与系统生物学的学科特点,可以考虑基于以下几点：“组学”技术不是对个别基因或个别蛋白、代谢物的研究,而是对一个细胞或整个生命体的基因以及它所编码的蛋白质和代谢产物的研究；基因转录翻译成蛋白质的过程中存在着剪接、加工修饰、构象变化和转运定位等蛋白质活动规律的变化,因而证候的基因转录水平并不能完全代表证候的蛋白质水平状况；代谢组学强调把机体作为一个完整的系统来研究,符合证候的特征。因而我们推测,证候的物质基础可能是由功能相关的基因群或蛋白质群体表达异常及特异代谢组分共同构成。由此,在证候本质的研究中引入并联合采用基因组学、蛋白质组学和代谢组学等现代系统生物学理论和技术对目标组织同步检测,以获得证候基因表达谱、证候总体蛋白质表达图谱、证候相关代谢群谱,再运用生物信息学技术将这3张图谱与证候进行关联分析,从而更全面、更确切地揭示证候的动态发生机制。关于证候本质研究的未来发展趋势,我们建议,重点应该围绕“同病异证”和“异病同证”的证候进行整合系统生物学研究,在筛选到证候独特表达的差异基因、差异蛋白及差异代谢组分的基础上,进一步对这些基因、靶蛋白、代谢小分子之间的联系与相互作用进行深入探索,以鉴定证候的本质特征。【参考文献】 1 方肇勤.辨证论治实验方法学实验小鼠诊法和辨证M.上海：上海科学技术出版社,2006.100.2 方肇勤,潘志强,汤伟昌,等.小鼠“四诊工作站”构建与操作标准探讨J.上海中医药大学学报,2006,20(1)：4246.3 方肇勤,潘志强,付晓伶,等.小鼠四诊采集项目标准的建议J.中国中医基础医学杂志,2005,11(9)：692694.4 方肇勤,潘志强,卢文丽,等.小鼠常见证候的辨证标准J.中国中医基础医学杂志,2006,12(7)：508510.5 方肇勤,潘志强,卢文丽,等.大鼠、小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价J.中国中医基础医学杂志,2007,13(7)：502505.6 宋剑南.论中医证候基础研究的模式和方法J.中国中医基础医学杂志,2007,13(2)：8183.7 沈自尹.我的科研历程和思考J.中医杂志,2000,41(11)：690692.8 申维玺.论中医“证”的现代医学属性和概念J.中医杂志,2001,42(5)：307309.9 王米渠.中医遗传学M.西宁：青海人民出版社,1997.245291.10 王 忠,王 阶,王永炎.后基因组时代中医证候组学研究的思路J.中国中西医结合杂志,2001,21(8)：621623.11 张立华,高学功.中医“证”与“辨证”之浅见J.时珍国医国药, 2002,13(7)：412413.12 王永炎,张启明,张志斌.证候要素及其靶位的提取J.山东中医药大学学报,2006,30(1)：627.13 罗和古,陈家旭.代谢组学技术与中医证候的研究J.中国中医药信息杂志,2007,14(5)：35.14 吴苏冬,周冬枝,贾宗良,等.结肠癌脾虚证p53,Bcl-2和Bax的表达J.第四军医大学学报,2003,24(12)：11111113.15 胡 玲,劳邵贤.胃癌前病变p21ras,c-erbB-2,p53表达与中医证候的关系J.世界华人消化杂志,2004,12(2)：262265.16 杨焕明.基因组学中医药学现代化的一个切入点J.医药世界, 2000,(8)：57.17 宋为民,王明艳,徐 力.基因组学是中医现代化的最佳切入点J.南京中医药大学学报,1999,15(4)：193195.18 沈自尹.21世纪中西医结合走向后基因组时代J.中国中西医结合杂志,2000,20(11)：808810.19 方肇勤.基因芯片技术现状及其在中医基础实验研究中的应用J.上海中医药大学学报,2001,15(1)：1719.20 王米渠,杨丽萍,丁维俊,等.一个寒证家系中发现15个差异表达基因的报告J.中医杂志,2006,47(2)：131133.21 高 黝,高 泓,王米渠.1个糖尿病家系肾阴阳两虚血瘀证糖尿病的差异表达基因分析J.现代中西医结合杂志,2005,14(1)：15.22 王 肃,邹世洁,陈小野,等.利血平脾虚证模型海马基因表达谱变化的研究J.现代中西医结合杂志,2004,13(7)：841844.23 盛学仕,方肇勤,管冬元,等.DEN诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变J.中国中医基础医学杂志,2005,11(10)：737746.24 潘志强,方肇勤,卢文丽,等.阳气虚和气阴阳虚证荷瘤小鼠肾上腺基因表达的差异性J.上海中医药大学学报,2008,22(3)：4550.25 余宗阳,杜 建.蛋白质组学与中医证实质研究J.中国中西医结合杂志,2004,24(9)：844846.26 杨元宵,李昌煜.运用蛋白质组学研究中医证候的思考J.中国实验方剂学杂志,2007,13(1)：6972.27 马增春,高 月,谭洪玲,等.四