节微生物的生长

1,第七章 微生物的生长和遗传变异,第一节 微生物的生长及其特性 第二节 微生物的遗传 第三节 微生物的变异 第四节 遗传工程 第五节 微生物的驯化与保藏,2,第一节 微生物的生长及其特性,一、生长与繁殖的基本概念 二、微生物生长的测定方法 三、微生物的生长特性 四、微生物膜的生长特性,3,一、生长与繁殖的基本概念,何谓生长？同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。,何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂，这就是细菌的繁殖。,个体的生长和繁殖体现为群体的生长。（微生物重量或数目的增加）。 群体生长个体生长个体繁殖,在微生物学中“只有群体的重复”才更有意义，因此“生长”一般指群体生长。,4,二、微生物生长的测定方法,定量测定方法,5,1. 计数法,（1）直接计数法（显微镜）,涂片染色法： 一定量样品涂布在载玻片上，染色后计数。 滤膜染色法： 一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。,7,5-DTAF : 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein,DTAF染色法,8,计数器法: 如血球计数板法,比例计数法： 将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。（特点：不需测量体积）,9,活细胞染色法,10,Tetrazolium salt reduction method,四氮唑化合物（染料）染色法,11,常用的四氮唑化合物（染料）,12,CTC : 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride,13,双重染色法,14,低活性细胞的计数（细胞增大技术） DVC(Direct Viable Count) method,15,（2）间接计数法（活菌计数法）,平板计数法：测定菌落数，（注意：可培养的微生物很少） 描述：CFU（colony formation unit）,液体计数法（MPN法，most probable number法）： 最可能数法 主要用于在平板培养基上不易形成菌落的菌 （硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）,液膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养）,16,17,（3）特定微生物计数法,FISH（荧光杂交法）Fluoreseuce In situ hybridization 16sRNA的碱基组成设计特异的探针（probe）,选择性培养基法,18,Principle of fluorescent in situ hybridization (FISH),19,FISH法的步骤,20,10m,FISH法,DTAF染色,土壤中微生物的测定(例子),微生物,同视野,21,2. 生物量法,（1）测体积：离心或自然沉降后观察体积(粗放的方法),（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种 105110C下干燥后称重（干重约为湿重的1020%）,活性污泥浓度测定方法：,（3）比浊法/光密度法 OD（optical density）450660nm, 可见光,22,（5）细胞含氮量 细菌含氮量12.5%、酵母为7.5% 粗蛋白量6.25N量,（6）DNA、蛋白质 同一微生物的DNA和蛋白质含量相对稳定， 所以可以通过测量DNA、蛋白质的量评价生物量。,（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量,（8）微生物呼吸醌类 1g含活性污泥平均约含1mol呼吸醌类。,23,三、微生物的生长特性,1、间歇培养（Batch cultivation）和生长曲线（growth curve）,间歇培养：将少量微生物接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。,生长曲线：细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。,24,总细胞数,微生物的典型生长曲线,25,0,0,时间,微生物数,生长速度,缓慢期,对数期,稳定期,衰亡期,活菌数,总菌数,微生物生长曲线（按微生物数目的对数绘制）,26,27,缓慢期(亦称延滞期, lag phase）,影响缓慢期长短的因素： 接种龄：种子（inoculum）处于什么生长期。 、 接种量：特别是X0/S0，即初期微生物浓度与基质浓度的比。 培养基成分,产生缓慢期的原因：缺乏分解有关基质的酶； 缺乏充足的代谢中间产物,特点：生长速率常数近于零 细胞形态变大 rRNA含量增高 合成代谢较活跃,28,2）对数期（stationary phase） 亦称指数期（exponential phase）,最短,细胞数（量）以指数形式增加的时间段。 特点： 生长速率最大，世代时间（generation time） 倍加时间（doubling time） 酶系活跃、代谢旺盛 细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀,29,指数期的数学描述,30,3）稳定期（stationary phase）： 亦称恒定期、最高生长期、生长速率下降期等,特点：净增长速度接近零,生长速率下降阶段,S很低，其浓度对微生物影响大,即有机物分解速率与其浓度成正比,出现稳定期的原因：,营养物尤其是生长因子耗尽 营养物比例失调 代谢物的积累 pH、DO、氧化还原电位的变化,31,出现衰亡期的原因：,营养物不足（代谢产物的积累） 外界条件恶化,32,2、间歇培养时微生物生长的数学描述,（1）生长与基质浓度的关系,微生物比增长速度：,单位时间，单位微生物量的增加量,33,KsS时,Monod公式（莫诺特公式）经验公式（微生物增长）,34,1)对数期：b x 项忽略不计,(2)细胞浓度变化：,a: 合成系数/菌体收率 污染物转化系数,b: 内源呼吸常数,35,2）稳定期（生长下降期 ）：,X 变化不大;,xconst,36,微生物生长期与废水生物处理： （活性污泥等的混合微生物群，也有类似的生长曲线。),水处理中如何避免缓慢期,微生物维持在对数期可获得高的处理能力，即分解速率，但处理效果 不一定好,37,处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好。 故传统的活性污泥法常运行在这个范围。,衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合， 如延时曝气及污泥消化。,38,食料/微生物比,代谢速率,内源呼 吸阶段,生长率 下降阶段,生长率上升阶段,（沉降性能好）,（沉降性能差）,大多数活性污泥处理系统运行范围,延时曝气，污泥消化,微生物代谢速率与食料/微生物比的关系,39,40,5. 分批补料式培养（fed batch） 以低速把高浓度的营养物质连续加入培养器中，但不排出物料。,特点：能任意控制培养液中的底物浓度，所以没有流出。供应速度与微生物消费速度达到平衡，所以能保持一定的浓度。,主要用于： 有抑制作用的底物 生长因子添加 高浓度菌体培养,41,四 、 微生物膜的生长特性,1. 生物膜的生长,液体培养基中加入固体物质(载体)，微生物在其表面吸附、生长、繁殖形成形成膜，这种膜叫微生物膜。,42,从单位固体表面积上的微生物量(mg/cm2)上看可分为6个阶段,a. 延滞期 b. 加速增长期 c. 恒速增长期 d. 减速增长期 e. 安定期 f. 脱落期,微生物膜的生长模式图,43,微生物膜的生长过程中密度的变化,随着膜厚的增加，密度也发生变化,44,微生物膜内部的密度变化,45,（1）延滞期：细胞吸附在固体表面上的过程（沉降）,影响吸附速度的因子： 材质、表面性质、形状、细胞的性质、操作条件,（2）加速增长期：还没有形成完整的膜,（3）恒速增长期： 活性细胞量达到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。,46,（4）减速增长期： 恒速增长期与安定期的过渡期，持续时间短。,（5）安定期： 增长速度与脱落速度相平衡，膜量及膜厚达到最大值。,（6）脱落期： 外因：流体的剪切力 内因：微生物的死亡、气泡的形成，细胞外高分子量的变化。,47,2. 生物膜的特性,（1）有效膜厚,70200m（平均100 m），并不是越厚越好。,48,生物膜菌群的空间分布的测定,试验方法 荧光原位杂交技术（FISH） 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM） 用途：荧光信号的定位检测和定量分析。,试验所用荧光探针的性质,49,生物膜内微生物总体的空间分布,硝化菌群主要存在于厚度为2035m左右的表层,硝化菌群沿生物膜厚度（z方向）的分布情况,生物膜厚度约为80120m左右,50,（2）密度（与膜厚