《食用菌菌种生产》PPT课件.ppt

,第二章 食用菌菌种生产,菌种是指经人工培养并可供进一步繁殖或栽培使用的食用菌纯菌丝体。菌种是食用菌生产的基础。我国食用菌菌种生产目前采用母种、原种、栽培种的三级繁育程序。无论制作哪一级菌种，关键应强调无菌操作，严格按照无菌技术要求进行。,菌种的类型 在生产中根据菌种的来源、繁殖代数及生产目的，把菌种分为母种、原种和栽培种。分别叫一级种、二级种、三级种。,菌种按生产程序,一级种 (母种）,二级种（原种）,三级种(栽培种）,第一节 菌种生产的基本设备 一、接种设备 接种设备是指用于分离和扩大培养各级菌种的专业设备和工具。包括接种室、接种箱、超净工作台、接种工具、酒精灯等。 （一）接种室 又称无菌室，是分离和移接菌种的小房间。它分为内外两间，每间面积一般以48m2为宜，一般内装一只功率为30W的紫外线灯。其内间为接种工作间，56m2，内置工作台，要求门窗能密封，这样能减少灰尘积累和便于消毒。,外间为缓冲间，23m2，用于进接种间之前更换衣、帽、鞋，同时为内间提供与外界相隔的小环境。内外间均为拉门，两门的位置不能处于一条直线，应相互错开。内外间墙、地板、天花板、室内用具等应尽量光滑易擦洗。 （二）接种箱 用于分离、移接菌种的专用木箱，实质上也是一个缩小的接种室。它要求密闭严实，操作方便，易于消毒。内装一只日光灯用于照明，一只紫外线灯用于消毒。,接种箱的类型很多，因规模受限制，目前一般大小为长143cm、宽86 cm 、 高159cm、分双人和单人操作两种类型，箱的上层两侧安装玻璃，能灵活开闭，以便观察和操作。,（三）超净工作台 为局部净化空气的设备，其原理是对空气进行过滤除菌。它的最大优点在于分离、接种时安全可靠，接种数量不受无菌空间的限制，操作方便。但其价格昂贵，实际生产中受到限制。,（四）接种工具 包括接种针、接种环、接种钩、接种锄、接种铲、接种耙、接种刀、镊子、接种器等。 （五）酒精灯 酒精灯主要用于接种工具的烧灼灭菌和小范围内无菌接种。酒精灯点燃时，其火焰附近10cm范围内会形成一个无菌区。在菌种分离、移接时，一般应在酒精灯周围进行。,二、培养设备 用于培养接种后的各级菌种、并使菌丝生长良好的专用设备。培养设备可提供适宜温度和通气条件，如保温、调湿、避光、通风等。主要有培养室、培养箱等。 三、灭菌设备 灭菌是指用化学的或物理的方法杀灭物体表面和内部的一切微生物，使之达到无菌状态。一般采用热力灭菌设备。热力灭菌是利用高温使菌体蛋白质变性而失去活性，达到灭菌的目的。热力灭菌设备分干热灭菌设备和湿热灭菌设备，常用的为湿热灭菌设备，根据压力指标主要包括高压蒸汽灭菌锅和常压蒸汽灭菌灶两类。,第二节 培养基的配制 一、培养基的种类 培养基是指采用人工的方法，将食用菌所需要的各种营养物质按照一定比例配合而成的营养基质。 培养基可按其物理性状和营养物质的种类两方面进行分类。 （一）根据培养基的物理性状分类 根据培养基制成后物理状态的不同，可分成液体培养基、固体培养基和固化培养基三种。,1、液体培养基 液体培养基是指将食用菌生长发育所需要的营养物质按一定比例加水配制而成的液态的培养基。它的优点是营养成分分布均匀，有利于食用菌营养体充分接触和吸收。生产上常用于培养液体菌种或生产某些食用菌的菌丝体及其代谢产物，实验上多用于生理生化方面的研究。,2、固体培养基 以含有纤维素、木质素、淀粉等各种碳源物质为主，添加适量有机氮源、无机盐等，含有一定水分呈固体状态的培养基。优点是原材料来源广，价格低廉，配制容易，营养丰富，因此是食用菌原种、栽培种的主要培养基。,3、固化培养基 指将各种营养物质按比例配制成营养液后，再加入适量的凝固剂，使之加热至60以上呈液态，冷却到40以下时则呈固态的培养基。常将其制成斜面培养基或平面培养基以供培养食用菌母种用。,（二）按照营养物质种类分类 根据培养基营养来源不同，分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基三大类。,1、天然培养基 天然培养基是指利用化学成分不清楚且不恒定的天然有机物质配制而成的培养基。各种农副产品、下脚料（如小麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、麦麸、木屑等）以及动植物组织浸出液（如牛肉膏、麦芽汁、肉汤等）均为常用原料。这些有机物来源广，价格便宜，营养丰富，是食用菌生产中最常用的培养基。但是不能用之进行精细的科学实验。,2、合成培养基 利用已知成分和已知数量的化学试剂配制而成的培养基。价格较昂贵，一般只限于实验室进行食用菌生理生化方面的研究。,3、半合成培养基 培养基中既有天然有机物质又有无机盐类，称半合成培养基。这种培养基种类多。应用最为广泛，也是食用菌菌种生产中常用的培养基。,（三）其他分类方法 此外，按照培养基表面形状又可把培养基分为斜面培养基、平面培养基和高层培养基； 按照培养基中主要原料的不同，可把培养基分为马铃薯培养基、棉籽壳培养基、玉米芯培养基、木屑培养基等。 另外，根据试验的特殊需求研制出一些特殊培养基，如基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择性培养基等，其中选择性培养基在食用菌的菌种分离纯化工作中应用较广。,二、培养基配制的一般原则 配制培养基时一般应具备以下三个条件， 第一，含有该菌生长发育所必需的营养物质如水分、碳源、氮源、无机盐、维生素等，并注意各种成分的浓度配比要合理。 第二，具有一定的生长环境，包括适宜的pH和渗透压等。 第三，必须经过严格的灭菌，使之保持无菌状态。,（一）水分 水分不仅是菌丝细胞原生质的主要成分，而且菌丝的一切生理活动菌需在有水的情况下进行。因此，在配置各种培养基时，应加入一定量的水分。,（二）碳源 单糖（葡萄糖）、双糖（蔗糖、麦芽糖）、多糖（淀粉）都是菌丝体能利用的有机碳源。,（三）氮源 氮素是构成菌丝细胞中的蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸又是细胞质和细胞核的主要成分，它们在生命活动中起着重要的作用。有机氮(如氮基酸、蛋白质、尿素)和氨态氮（如硫酸氨等）都是菌丝细胞所需氮素的主要来源。,（四）无机盐类 菌丝体所需要的无机盐类数量很少，但它们在菌丝体的生命活动中是不可缺少的，在配制培养基时一般要加入少量的磷、钾、硫、钙、镁等。磷酸氢二钾是一种磷酸盐类，具有缓冲作用，能防止培养基pH的急剧变化。,（五）生长素 生长素对菌丝体代谢活动有刺激作用。一般天然物质如马铃薯、麦芽汁、麸皮、米糠中均含有丰富的生长素，无需另行添加。配制培养基时加入少量的B族维生素，对菌丝生长有良好的作用。,（六）凝固剂 配制培养基常用的凝固剂为琼脂，又名洋菜，是由石花菜等藻类提取的一种多糖，其本身没有营养，主要起凝固作用，约96时熔化，40凝固，常用浓度为1.8%2%。,三、常用培养基及配制方法 不同食用菌的菌种对培养基种类的要求均有所不同，同一种食用菌也可同时使用几种不同的培养基。 （一）母种培养基 食用菌母种的培养基和分离菌种时使用的培养基一般都制成斜面试管，因此又常称为斜面培养基或试管培养基。母种培养基常用的基本物质有马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂和维生素B1等。,1、常用母种培养基配方 （1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基) 马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18 20g，水1000ml， pH自然。此培养基适于一般食用菌的母种分离、培养和保藏，广泛地应用于绝大多数的食用菌，是生产中最常用的培养基。,1、常用母种培养基配方 （2）马铃薯综合培养基 马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1. 5g，琼脂18-20g，维生素B1l0mg，水l000ml。此培养基适合于香菇菌种保藏和一般食用菌的母种分离、培养和保藏。,（3）完全培养基 MgSO 40.5g， K2HPO4 1g，葡萄糖20g， KH2 PO4 0.46g，蛋白胨2g，琼脂15g，水1000m1。此培养基为培养食用菌母种最常用的合成培养基，有缓冲作用，适宜保藏各种菌种。,（4）麦芽膏酵母膏培养基 （5）稻草浸汁培养基 （6）普通标准培养基 （7）苹果琼脂培养基 （8）高粱琼脂培养基 （9）酱油洋葱琼脂培养基 （10）木屑浸出汁培养基 （11）胡萝卜马铃薯培养基 （12）玉米粉培养基 （13）子实体浸出液培养基,2、母种培养基的配制原则 营养成分及比例适合该食用菌的生长发育。 酸碱度、氧化-还原电位适宜。 有一定的pH缓冲能力。,3、母种培养基的配制方法 （1）称重 用适当工具准确称量出各种营养成分。,（2）调配 将去皮、挖掉芽眼的马铃薯（或洋葱、稻草、胡萝卜、子实体等）切成小块，放入小钢精锅或大烧杯中，加入一定量的水，用文火煮沸30min左右，双层纱布过滤取汁。玉米粉或高粱粉加水后，一般加热至70左右，并保持60min，过滤取汁；麦芽则加热至6062，保持60min，过滤取汁。,（3）加入琼脂溶解 先将滤液补足失水，再将琼脂预湿后加入滤液中，文火加热搅拌至全部溶化。 （4）加入配方中其他营养物质。 （5） pH测定与调整 充分搅拌均匀，用pH试纸侧定pH，并按食用菌所需的最适pH，用lmol/L NaOH或1 moI/LHCI进行调整。,（6）过滤分装 用纱布过滤，取汁趁热分装。培养基的分装量应为试管长度的15或14。操作时应尽量防止培养基黏在试管口或壁上，若已黏上应立即用纱布或脱脂棉擦净。,（7）加棉塞、包扎 装好培养基的试管应及时塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的原棉。棉塞要大小均匀、松紧适宜，长度一般为45cm，一般要求2/3留在试管内，1/3露 在试管外。然后把塞好棉塞的 试管，每710支捆扎成一把， 用牛皮纸或双层报纸包扎，再 用皮套扎紧或棉线捆好，放入 手提式高压锅内灭菌。,（8）灭菌 用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。步骤为：加热升温压力至0.05MPa时，放气阀打开，排冷气压力为0，关闭排气阀继续升温，压力至0.15MPa，持续2030min压力降至0。,（9）摆斜面 灭菌完毕后，让其压力和温度自然降至零后，立即取出培养基，在清洁的台面或桌面上倾斜摆放，摆成斜面，一般斜面长度以达试管全长的1/2-2/3为宜。,（二）原种和栽培种培养基 原种培养基和栽培种培养基的配制基本相同，只不过原则上制作原种的培养基要更精细些，营养成分应尽可能丰富，而且还要易于菌丝的吸收，以便移接的母种菌丝能更好生长发育。用于原种培养基的配方。一般也适用于栽培种培养基。,1、原种和栽培种常用培养基配方 （1）木屑培养基 阔叶树木屑（或竹屑）78%，麸皮（或米糠）20%，糖1%，石膏粉1%。此培养基适用于木腐菌的原种、栽培种的培养，如香菇、平菇、木耳、金针、猴头、灵芝，特别适宜于香菇菌种生产。,（2）棉籽壳培养基 棉籽壳78%，麸皮20%，蔗糖 1 %，石膏粉1%。此配方适用于金针菇、平菇、风尾菇、草菇、银耳、木耳、猴头等。 （3）甘蔗渣培养基 甘蔗渣75%，麸皮或米糠24%，石膏粉1%。适用于平菇、风尾、金针菇、草菇、木耳、白灵菇等原种、栽培种的培养。,（4）谷粒培养基 以小麦、高粱、玉米等为主料制作的培养基为谷粒培养基。 （5）粪草培养基 （6）木条木块培养基,2、原种和栽培种培养基的制备 在大规模生产中，原种和栽培种的培养基一般多为固体培养基。 （1）称量和拌料 首先按配方分别称取新鲜无霉变的培养料，充分搅匀后，检查并调节好水分和pH，然后即可装瓶或装袋。,（2）装瓶、装袋 在分装棉籽壳、玉米芯、木屑等培养基时，上下料的松紧度要求一致，装至瓶肩，压平表面，用直径1. 5cm的锥形捣木的尖端，在瓶内或袋中央打1个孔，其深度要临近瓶底，有利料中通气和固定菌种块的作用。然后用干布擦净瓶口，用牛皮纸、塑料布扎口，或用棉塞塞住。以塑料袋代替瓶装料时，应配制适量的木屑培养基，要求袋的厚薄均匀、无砂眼，并要消除料中的尖利杂物后才可装料，边装边压实，装止离袋口45cm处，加口圈再用纸扎口即可。,（3）灭菌 将已装好料的瓶或袋进行高压或常压灭菌，冷却后即为制备好的原种和栽培种培养基。,二(三)级种装瓶,第三节 消毒与灭菌 在食用菌制种和栽培中，为了能对食用菌进行纯培养，必须消灭或抑制有害微生物的活动，此过程称为消毒或灭菌。,一、消毒与灭菌的概念 消毒与灭菌是不同程度杀灭有害微生物的方法。根据对微生物杀灭程度的不同，将杀菌分为灭菌、消毒和防腐三个等级。 消毒是利用物理或化学的方法，消灭料中、物体表面及环境中的一部分微生物，即一般以杀死有害微生物为目的，但不能杀死微生物的休眠体（细菌芽孢）。,灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程，即杀灭物体上包括芽孢在内的所有病原性和非病原性微生物的方法。 防腐是指防止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。 无菌是指不含活菌的意思。防止微生物进人机体或物体的操作方法，称为无菌操作或无菌技术。,二、消毒与灭菌的一般方法 （一）物理消毒灭菌法 1、热力灭菌法 热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌。在同一温度下，后者效力比前者大。,（1）干热灭菌 烧灼 直接用火焰把微生物烧死的灭菌方法，又称火焰灭菌法。 仅适用于金属接种工具(如接种针)、试管口和污染物品等的灭菌。 方法是将需灭菌的器具在火焰上来回通过几次，火焰温度可达到200以上，一切微生物的营养体和孢子体可全部杀死。,干烤 又称热空气灭菌法，即在烤箱如电热恒温干燥箱、电热鼓风干燥箱中利用热空气来灭菌。 一般是将待灭菌的物品用牛皮纸或旧报纸包好，加热至160170经2h或140160经3h即可。注意灭菌结束后一定要自然降温至60以下才能打开箱门。 适用于高温下不变质、不蒸发的物品，如玻璃器皿、瓷器用具等。,（2）湿热灭菌 煮沸法 1.0105Pa时，煮沸的水温为100，一般细菌繁殖体煮沸5min即被杀死。细菌芽孢常需煮沸12h才被杀死。水中加入2%碳酸钠，既可提高沸点达105，促进细菌芽孢的杀灭，又可防止金属器皿生锈。,巴氏消毒法 用较低温度杀灭物体中的病原菌，同时又不影响消毒物的营养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8经0.5h即可。常用于牛奶和酒类等的消毒。,间歇灭菌法 间歇灭菌法是利用反复多次的流通蒸汽加热，杀死细菌所有繁殖体和芽孢的灭菌法。 具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺流通蒸汽灭菌器内，100加热1530min，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37温箱中过夜使芽孢发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽孢全部杀死。 该方法适用于不耐高温的药品、营养物、特殊培养基的灭菌。,高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法是利用高温高压蒸汽灭菌的方法，也是目前灭菌效果最好、使用最为广泛的一种灭菌方法。 通常液体培养基在1.0105Pa的压力下，温度达121.3，维持1530min，可杀死包括细菌芽孢在内的所有微生物。 对固体培养基，如木屑、棉籽壳、谷粒、粪草等必须在1.47105Pa的压力下，温度约为128，处理12h，才能达到满意的灭菌效果。,常压蒸汽灭菌 采用自然压力即1.0105Pa，100蒸汽进行灭菌的方法。设备简单，成本低，一般水烧开后保持810h，闷一夜即可。,2、辐射灭菌法 （1）紫外线 紫外线波长为240280nm时具有杀菌作用，其中以260nm最强。紫外线穿透力差，只适用于空气及不耐热物品的表面消毒。 （2）电离辐射 即射线灭菌法。高速电子、x射线和射线等的波长极短，但它们的辐射能极大，在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。 （3）微波灭菌 微波是指波长1000m1000mm的电磁波。,3、滤过除菌法 滤过除菌也称过滤灭菌法，是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌的目的。所用的器具是滤菌器。滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、细菌毒素、抗生素以及空气等的除菌。目前常用的有滤膜滤菌器、石棉滤菌器、玻璃滤菌器等。,（二）化学消毒灭菌法 用化学药品进行消毒灭菌的方法，由于化学药品对细菌及人体都有毒，故只能用于体表、器械及周围环境等的消毒。 1、重金属及其盐类 大多数重金属包括它们的化合物是有效的杀菌剂或防腐剂，如汞、银、铝、锌、铜、铅等。但由于所有的重金属盐类对微生物、人和动物都有毒害作用，因此使用时要特别小心。,（1）氯化汞（升汞） 白色结晶体，杀菌力极强，主要用于食用菌的菌种分离及玻璃器皿、非金属器械的表面消毒。剧毒药品，需安全使用，妥善保管。 （2）硝酸银 呈液体状，0.1%1.0%硝酸银可用作皮肤消毒。 （3）硫酸铜 与石灰配制的波尔多液常用作菇房及床架的消毒。使用时用喷雾器喷洒，随配随用， 不宜久存。,2、氧化剂 常用的氧化剂有高锰酸钾、过氧化氢、臭氧、漂白粉、过氧乙酸、漂粉精片等。 3、还原剂 常用的有福尔马林，为还原性消毒剂，含甲醛37%40%，有较强的腐蚀性和刺激性。原液作熏蒸用，主要用于接种室、接种箱、培养室、栽培房等空间的消毒。5%的福尔马林可杀死细菌芽孢和真菌孢子。,4、表面活性剂 表面活性剂指具有降低表面张力效应的物质，常用的有苯酚、乙醇、来苏儿、新灭尔灵、肥皂。 5、酸碱 强酸和强碱较强的杀菌力。无机酸如硫酸、盐酸等，杀菌力强，但由于腐蚀性大，实际上不宜做消毒剂。某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂，强碱可用作杀菌剂，但由于毒性大，其用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。,6、其他消毒剂 （1）石灰 分生石灰和熟石灰。以4份生石灰加入1份水，即生成熟石灰，并放出热量，具有杀菌作用。 （2）硫黄 常用于培菌室和出菇房等空间熏蒸杀菌。 （3）消毒新产品 例如气雾消毒剂、AFD-A型华光食用菌制种消毒剂等。,第四节 接种与培养,接种：在无菌条件下，将母种或原种菌种移接到严格灭菌的培养基上的过程。 一、接种工具及用品 接种工具及用品包括接种针、接种环、接种钩、接种锄、接种铲、接种耙、接种刀、摄子、弹簧接种器、酒精、药棉、酒精灯、火柴、解剖刀、盛放废物的容器、记号笔等。,二、接种与培养 （一）母种的接种与培养 1、接种 母种的接种就是通常所说的母种的转管。在转管过程中至关重要的就是采用无菌操作技术，此项工作必须在接种箱或超净工作台的酒精灯火焰周围10cm的无菌区进行。,2、培养 将接种后的试管放入温箱内，于25左右的温度条件下培养。一般培养3d后，应检查菌丝生长情况或有无杂菌，培养715d母种菌丝即可长好。,（二）原种的接种与培养 1、原种的接种 首先用左手拿起试管，用右手拔棉塞，以便在酒精灯上消毒接种钩铲，一边把试管口向下稍微倾斜，用酒精火焰封锁，不让空气中的杂菌侵人。其次把消毒后的接种勾铲伸入菌种管内，稍微冷却，在伸入斜面菌种挑取一小块菌种，迅速移到原种瓶中培养料表面中央的接种穴内，菌丝向下紧贴培养基，再迅速塞好棉塞或用塑料布、牛皮纸扎口。,2、原种的培养 接种好的原种应移入培养室或培养箱内培养，待菌丝长满后即为原种。培养出的原种，应当菌丝浓白、健壮、纯净、生命力强，具有一定的清香味，无任何杂菌污染，且要在三个月内使用。,（三）栽培种的接种与培养 1、栽培种的接种 栽培种的接种是将原种移接到栽培种培养基上，待菌丝长满培养基即为栽培种。栽培种的培养基可为瓶装也可袋装。每瓶接入一大块原种或一小勺麦粒菌种即可。两人合作时，一人以无菌操作方法用接种勺或大镊子取一块原种菌丝，另一人帮助在酒精灯火焰旁打开栽培种袋口，迅速将原种接到袋中，塞好棉塞即可。,2、栽培种的培养 接种完毕，于25左右的培养室内培养。经3040d培养后，栽培菌种即可长满菌丝，供栽培使用。若在袋内长有原基，说明菌种老化；若有黄、绿、黑等杂色斑点或连成一片，说明菌种污染，均不可使用。,三、菌种质量鉴定 菌种质量鉴定主要包括两方面的内容：一是鉴定未知菌种的种类，从而避免菌种混乱带来损失，二是鉴定已知菌种质量的好坏，以便选择优良品种。 菌种质量的鉴定一般是从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、均匀度和出菇快慢等6方面进行鉴定的，最可靠的方法就是出菇试验。,一、母种质量鉴定,1、转管次数 最多不超过45次 2、菌龄 低温保存不超过6个月 3、外观 菌丝浓白、粗壮、富有弹性、爬瓶力强，没有干燥、收缩现象和大量红褐色液体。 4、长势 菌丝生长快、整齐、浓而健壮。 5、温度适应性 在适温培养后，放在高温下培养几小时，菌丝仍能健壮生长的。 6、干湿性鉴定 7、出菇试验,二、原种和栽培种质量的鉴定,原种、栽培种最好不做贮备菌种，按栽培时期有计划地生产。接原种的母种转管次数要少，一般不多于3次。,原种和栽培种的外观要求： 1、菌丝己长滿培养基，有的要求有分化的子实体原基。有菇香味，无异味。 2、菌丝生长健壮，绒状菌丝多，生长整齐。 3、菌丝色泽洁白或符合该菌的颜色。 4、菌种瓶内无杂色出现和无杂菌污染。 5、菌种培养基不能干缩与瓶壁分开。 6、菌种瓶内无黄色汁液渗出。,木耳,菌丝白色至米黄色，平贴培养基匍匐生长，菌丝短、整齐，生长速度个品种不同，日省长0.5厘米左右，在28的培养条件下1315天长满5厘米的斜面，满管后培养基呈浅黄色至茶褐色，见光情况下，斜面边缘或表面出现胶质琥珀状原基，毛木耳老化有红褐色、珊瑚状原基出现，培养温度28。,草菇,菌落分正常和不正常两种。菌丝浓密、均匀，灰白或淡黄色，透明状，生长快，厚垣孢子少为正常菌株；菌丝稀疏，成簇绒毛星散分布，生长速度慢，均为不正常菌株，不能继续使用，培养温度为30。,金针菇,菌丝白色，细绒棉状，稍有爬壁能力，生长速度与香菇相仿，老师菌落表面呈淡污褐色，低温保藏时，试管内菌落上面出现水珠以形成子实体。,平菇,菌丝白色，粗壮有力，气生菌丝发达，爬壁性强，菌丝密集，生长速度快，不分泌色素，具有耐高温性能，67天长满5厘米的试管斜面，低温保存，能产生珊瑚状子实体。,合格的菌种（左、右） 不合格菌种（中、老化）,合格的菌种（左中） 不合格菌种（杂菌、右）,第四节 菌种分离方法,菌种分离是菌种纯化的基本方法，是制种的重要环节。,将有价值的子实体的局部组织、孢子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得纯培养菌丝的操作称为菌种分离。,孢子分 离法,组织分离法,基内菌丝分类法（菇木分离法 ）,孢子弹射分离法,菌褶涂抹法,孢子印分离法,子实体组织分离法,菌核组织分离法,菌索分离法,整菇插种法,钩悬法,贴附法,平板稀释法,连续稀释法,菌 种 分 离,多孢子分离法,单孢子分离法,空中孢子捕捉法,显微操作分离法,稀释法,涂抹法,胶质菌丝的组织分离法,1、分离前的准备,培养基的选择,通常使用PDA培养基。特殊分离培养时，常采用相应的培养基。,种菇的预处理,种菇采摘后，若种菇水分太高，菇盖沾粘，可适当风干后再进行分离。胶质耳只能用无菌水多次冲洗，无菌滤纸吸干，然后让耳片子实层上重新产生成熟的孢子供分离，这样可降低污染率。,一、孢子分离法,在无菌操作条件下利用食用菌的有性孢子或无性孢子在适宜的培养基上萌发成菌丝体，而获得纯菌种的方法称为 孢子分离法。,特 点,菌丝菌龄短，因是有性繁殖产物，其菌丝生命力强。,侵染病毒的菌类可用孢子分离法脱毒。,孢子分离法得到的菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。 孢子分离法分为单孢分离法和多孢分离法。,（一）多孢分离法 就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。根据获取孢子的方法不同，主要有：孢子印分离法、孢子弹射分离法、菌褶涂抹法、空中孢子捕捉法等。,(1)孢子印分离法,取成熟子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20-24静置一天，大量孢子落下形成孢子印，然后移少量孢子在试管培养基上培养。,(2)孢子弹射分离法,孢子弹射分离法 它是利用孢子能自动弹射出子实体层的特性来收集孢子。, 贴 附 法,取一小块成熟的菌褶或小块菌盖，用溶化的琼脂或胶水、浆糊(需先灭菌)贴附在试管斜面的上方或培养皿皿盖上，经612h，待孢子落下后，立即将试管或培养皿中的培养基移到另一消毒过的空试管或培养皿中进行培养。, 钩 悬 法,在生产上，采集木耳、银耳孢子常用此法，伞菌也可采用此法。,先将新鲜成熟的耳片用无菌水冲洗，然后用无菌纱布将水吸干，取一小片挂在灭菌的钩子上(伞菌则消毒后挂上），钩子的另一端挂在三角瓶口。,瓶内装有培养基，在25下，培养24H。孢子落到培养基上后，取出耳片，塞上棉塞继续培养，然后再转入试管中培养。,2-3天后孢子散落在培养皿中，加入无菌水，用针筒吸取孢子液，接种在斜面培养基中央，置于22-26恒温箱中培养即可。,整菇插种法,4、菌褶涂抹法,将伞菌子实体用75酒精表面消毒，按无菌操作用接种环直接插入两片菌褶之间，轻轻地抹过褶片表面，然后用划线法涂抹于试管培养基上。,3、空中孢子捕捉法,在子实体周围形成“孢子云”的上方倒放培养基平板或将装有培养基的试管口对准孢子云飘动的方向，使孢子附着在培养基表面，再盖上皿盖或塞上棉塞，用塑料胶水纸封好培养。,孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂菌的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。,孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。一般菌类如平菇、凤尾菇、香菇、金针菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。,二、单孢子分离法,进行单孢子分离后，在人工控制的条件下，使两个优良品系的单孢子进行杂交，从而培育出新品种。,2、稀释法,显微操作器分离单孢主要用于杂交育种、孢子极性的研究等。操作前都需要一定的技术训练，适合有条件的科研单位使用。,1、显微操作分离法,(1) 连续稀释法,挑取一定量孢子，经连续稀释后，直到每滴稀释液中只有一个孢子，然后滴入试管中保温培养。当发现单个菌落时，转到新试管中继续培养，并通过镜检以确定是否为单孢菌落。,（2）平 板 稀 释 法,挑取少许孢子在无菌水中形成孢子悬浮液，取几滴涂于培养基上，用无菌玻璃三角架推平。经48-72h后，镜检孢子萌发情况。在单个孢子旁做好标记，然后将其转接到斜面培养基上，待菌落长到lcm左右时进行镜检，观察有无锁状联合；初步确定是否是单核菌丝。,2、涂抹法,孢子液制备 取多孢分离所收集的抱子印，用沾湿无菌水的接种环从抱子印中沾取少量抱子，放入无菌水试管中，充分振荡。 接种、培养 将Iml无菌吸管吸取的孢子悬液加1-2滴2%琼脂于培养皿平板中央混合，用消毒的玻璃刮铲涂抹抱子悬液，使均匀分布在整个培养皿的平板上，放人25温箱中培养。 筛选 找到萌发的孢子，用尖细的接种针或细玻璃棒针将单抱子挑出，移入新的培养皿平板或试管斜面中培养。,二、 组织分离法,组织分离法 是利用子实体内部菌肉组织来获得菌种的一种最简便的方法，是生产上常用的一种分离菌种的方法。,组织分离是一种无性繁殖过程，所得到的菌种是营养后代，后代不易变异，菌株可保持原品种的优良品质。但如采用感染病毒的子实体进行组织分离时，常得到带病毒的菌丝体。,（一）子实体组织分离法（以伞菌为例） 组织分离时，用75%酒精棉球擦拭双手及接种工具。点燃酒精灯，将尖头镊子烧灼灭菌；随后将种菇纵向撕成两半，于菌柄、菌肉交界处切取火柴头大小的组织块，迅速抖落到试管中，烧灼管口 及棉塞，塞上棉塞。这些操作都是在酒精灯火焰无菌区域进行的。,（二）胶质菌类组织分离法,一种方法是将耳片反复用无菌水冲洗，切成0.5cm小块移入培养基，于28下进行培养； 另一种方法是剖取尚未展开耳片的耳基团内的组织块进行分离。,茯苓、猪苓等的子实体不易采集，而它们的菌核却易获得，利用菌核分离，能得到该菌的纯菌种。,将菌核表面洗净，用75酒精溶液消毒，切开菌核，取中间一小块组织接种在PDA斜面培养基上，塞上棉塞，在25下培养。,（三）菌核组织分离法,在挑取组织块时，应取大一点，因菌核是贮藏器官，其大 部分是由贮藏物质一多糖物质构成，仅有少量菌丝。若挑得过小，只挑到贮藏物质而没有挑到菌丝，分离就不成功。,蜜环菌、假蜜环菌等子实体难得，也无菌核，可用菌索来分离获得其菌种。,用沾有75酒精溶液的棉花将菌索表面黑色皮层轻轻揩擦23次，在无菌操作条件下去掉黑色外皮层(菌鞘)，抽出其中白色菌髓部分，用无菌剪刀将菌髓剪下一小段，移植在培养基上，保温培养，即可获得菌种。,菌索比较细小，在分离时极易污染，因此在培养基中应加入适量的抑菌的青霉素或链霉素。,（四）菌索分离法,三、基内菌丝分离培养法,利用食用菌生长发育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。,此种分离方法适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得子实体的品种。基内分离法与组织分离法不同之处是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等。,菇木分离法,菇木分离法,利用菇木中菌丝的分离而获得纯菌种的方法。 这种方法污染较大,能用孢子分离或组织分离的菌类，一般不用这种方法。,在自然界，银耳菌丝与香灰菌丝在一起才能产生银耳子实体，而用长有菌丝的段木来分离，能同时得到银耳菌丝及香灰菌丝，因此，生产上用的银耳菌种常采取菇木分离法，香菇、木耳等菌类也可采用菇木分离法,（ l）菇木的选择与处理,菇木应在子实体发生季节采集，由于菇木含有很多水分，细菌繁殖较快，分离易受污染，需将分离材料风干，则分离成功率较高。,分离时仅需取1cm厚的一片或一块菇木，一般选取菇木的中间部位，不取两端，因两端裸露在外，污染率高。,将菇木切成2-25m3的小块，用01的升汞水浸泡0.25lmin，然