人类辅助生殖技术应用概述

人类辅助生殖技术应用概述,中山大学附属第一医院 徐艳文,人工授精 夫精人工授精 赠精人工授精 常规体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET） 常规体外受精 单精子卵胞质内注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI） 射出精 睾丸/附睾精 植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnsosi, PGD）,人类辅助生殖技术,适应证 男方因素 宫颈因素 免疫因素 女方排卵障碍 不明原因性不孕 步骤,夫精人工授精,临床妊娠率10-15%,2010-5-15,中山大学附属第一医院,促排卵治疗,诱发排卵 有排卵障碍的情况下 以诱发单个卵泡或少数卵泡的发育为目的 超排卵 在可控制的范围内诱发多卵泡发育和成熟 为ART奠定基础 治疗的对象很多本身有正常的排卵功能,2010-5-15,中山大学附属第一医院,IUI中促排卵的作用,授精时间更精确 纠正排卵障碍 提供更多可用的卵子,步骤 药物促排卵 经阴道穿刺取卵 体外授精 胚胎培养 胚胎移植 胚胎冷冻 新鲜周期失败后解冻胚胎移植,常规体外受精-胚胎移植 in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET,GnRH激动剂：达必佳，达菲林 GnRH拮抗剂：加尼瑞克，思则凯 Gn： 重组FSH：果纳芬，普丽康 尿源性FSH：丽申宝，福特蒙 尿源性FSH和LH：贺美奇，HMG,主要药物,促排卵方案-短效长方案,GnRH-a 0.1mg qd,月经第二十天黄体中期,GnRH-a 0.05mg qd,Gn,14-21天,垂体达降调节标准,主导卵泡达18mm时注射HCG，36hr后取卵,促排卵方案-长效长方案,月经第二十天黄体中期 GnRH-a 1.3mg单次注射,Gn,14-21天,垂体达降调节标准,主导卵泡达18mm时注射HCG，36hr后取卵,促排卵方案-拮抗剂方案,Gn,主导卵泡达18mm时注射HCG，36hr后取卵,月经第2-3天启动,促排5-6天加拮抗剂,ART临床治疗风险,穿刺并发症 血栓栓塞 妊娠相关并发症 其它风险,经阴道穿刺取卵术并发症,严重并发症（0.5%-1.5%） 阴道出血100ml 0.8% 盆腔感染 0.6% 盆腔脓肿 卵巢扭转 盆腔出血,卵巢过度刺激综合征,取卵术后卵巢改变,非常脆 容易撕裂 通过测定Hb和Hct的变化，推测通常取卵术后平均出血量232130 mL,避免在卵巢内横向摆动,卵巢过度刺激综合征 （ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）,-促排卵最严重的医源性并发症 -正常妊娠中罕见 *发生率: - 轻度： 8 23% - 重度： 3.5-8% COH - 轻中度：7.3% - 重度： 4.2%,病理及临床表现,体液外渗,毛细血管 通透性增加,胸水、腹水、心包 积液、全身水肿,低血容量,血液浓缩 高凝状态,肾灌注减少,少尿、无尿,电解质紊乱,血栓形成,氮质血症,腹胀、恶心、呕吐 咳嗽、气促,卵巢过度刺激综合征 （ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）,临床表现 卵巢体积显著增大 血液浓缩，腹腔积液，胸腔积液 少尿 电解质紊乱 血栓形成、ARDS及多器官功能衰竭,OHSS分度,OHSS分度,根据OHSS发生的时间，又分为早发型OHSS和晚发型OHSS 早发型发生在HCG后37天，其发生与卵巢对促性腺激素的反应性有关，并且被外源性HCG激发 晚发型HCG后1217天，多伴有多胎妊娠，系内源性HCG所致 晚发型OHSS程度往往比早发型严重,体外授精-胚胎移植的实验室步骤,实验室仪器设备 实验室质控 体外授精 胚胎培养 胚胎移植 胚胎冷冻 胚胎解冻,体外授精-胚胎移植的实验室步骤,A、显微操作系统 B、程序冷冻仪及液氮罐 C、CO2浓度测试仪和温度测试仪 D、电子天平，超纯水仪和渗透压仪 E、冰箱 F、空气净化设备 G、CO2和N2，混合气体气瓶,实验室的仪器和设备,1、显微镜 A、相差显微镜 B、体视镜 C、倒置显微镜 D、荧光显微镜,实验室的仪器和设备,IVF工作站,实验室的仪器和设备,CO2培养箱：,实验室的仪器和设备,Thermo,K-system G-185,Cook MINC Benchtop Incubator,1、质量控制： 温度：233 湿度：30 60% 气压： 10Pa 尘埃：百级（配子操作区），万级（胚胎实验室），十万级（更衣室，取精室） 可挥发有机物（VOC）： 0.5ppm 振动，光照及噪音：,胚胎培养实验室的质量控制和管理,2、管理： A、按功能和清洁度分区 B、实验室禁止吃，喝，抽烟以及使用化妆品 C、培养箱和温台的监测 D、冰箱的监测 E、液氮罐的监测,胚胎培养环境的质量控制和管理,实验室禁止使用酒精等可挥发性有机物和紫外照射 可用蒸馏水擦拭台面 可用专用洗涤剂擦拭可能会被污染的台面或者区域 可使用吸尘器吸走灰尘 培养箱的清洁和消毒,实验室的清洁,1、温度和湿度：37.00.1，90% 2、pH：7.1 pHi 7.2， 7.2 pHe 7.4 3、气体：CO2和O2 4、渗透压：270 290mOsm/kg,胚胎培养系统,培养基的基本组成 水：99% 无机盐：维持培养基的渗透压和酸碱度 碳水化合物：提供胚胎发育的能量 氨基酸：促进胚胎体内外发育 维生素：调控细胞代谢 激素和生长因子：促进胚胎发育 大分子物质：维持胶体渗透压，中和毒素 抗氧化剂：减少氧自由基对胚胎的损伤 螯合剂：螯合重金属离子 抗生素：防止污染,胚胎培养系统,培养液配制和平衡,胚胎培养系统,单气培养：CO2(5-6%)，O2(21%) 和N2(74%) 三气培养：CO2(5-6%)，O2(5%) 和N2(90%) 优势：更接近生理状态（2-8% O2）,单气培养和三气培养,1、精子的形态结构,精子和卵子,精子形态,精子变态示意图,2、卵子的形态结构,卵母细胞颗粒细胞复合体,GV 期,MI 期,MII 期,异常卵母细胞,1、常规体外授精,体外授精,精卵混合,精卵结合,2、卵胞质内单精子注射（ICSI）,人胚胎体外发育,异常受精,单原核,多原核,三原核,无原核,胚胎发育阶段：卵裂球的数目 胚胎形态学评分： 胚胎的碎片评分：,卵裂期评分标准,8-1-1,8-2-1,8-2-3,1期：囊胚腔小于胚胎体积的一半 2期：囊胚腔大于胚胎体积的一半 3期：完全囊胚，囊胚腔与胚胎体积相等,囊胚的发育阶段,1期,2期,3期,4期,5期,6期,4期：扩张囊胚，囊胚腔大于胚胎，透明带变薄 5期：孵化囊胚，胚胎部分孵出 6期：完全孵化囊胚,胚胎移植数目： 35岁以下第一周期：2个 35岁以上或者第二周期以上：3个 单胚胎移植：,胚胎移植,胚胎移植管装载,胚胎移植管,空气,空气,胚胎,培养基,1、精子冷冻： 2、卵子冷冻： 3、胚胎冷冻： 4、生殖组织冷冻：,配子和胚胎的冷冻及复苏,程序化冷冻（慢速冷冻） 玻璃化冷冻（快速冷冻）,冷冻方法,Slow cooling,- 0.3C/min,慢速冷冻法 将胚胎放入含有一定浓度的冷冻保护剂处理后，慢速降温（0.23/min ）, 在这个过程中，随着细胞外温度的逐渐降低和细胞外冰晶的形成，细胞以一种平衡的方式逐步脱水。直到温度降至-150 ，至于液氮保存。,玻璃化冷冻法 采用更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温，使细胞内外的液体均达到玻璃化状态,玻璃化冷冻过程（两步平衡法） 在不同浓度的冷冻液中进行平衡,ES,VS,2.装管,3. 投入液氮，在液氮罐中保存。,冷冻前,置入冷冻液后0min,置入冷冻液后4min,置入冷冻液后8min,囊胚冷冻前人工皱缩,皱缩前,皱缩后,控制性超排卵 B超监测下取卵 体外受精和胚胎培养,胚胎活检 对活检的细胞进行检测 选择胚胎移植入宫腔,植入前遗传学诊断(PGD),常染色体隐性遗传病 -thalassaemia Cystic fibrosis Spinal muscular atrophy Sickle cell disease,常染色体显性遗传病 Huntingtons disease Myotonic dystrophy Charcot-Marie-Tooth diseas