原位大鼠肾脏移植模型技术的改进.doc

原位大鼠肾脏移植模型技术的改进【摘要】 目的：为提高大鼠肾移植模型中供体肾脏的利用率，对供肾切取、大鼠输尿管吻合方法进行改进，建立从同一供体切取双侧肾脏分别进行原位肾脏移植的方法。方法：分别切取供体的左、右侧肾脏，经肾脏动脉进行灌注；供肾的肾动脉、静脉分别与受体左侧的肾脏动、静脉血管端端吻合，并应用暂时性内支架辅助的方法进行供肾输尿管与受体输尿管上段直接吻合，同时切除受体右侧肾脏。比较左、右侧供肾受体成活率及术后并发症，并通过病理切片评价移植物的组织学变化。结果：从30个供体大鼠切取52只肾脏，分别施行左、右侧供肾肾脏移植28、24例。与常规单侧供肾相比节约大鼠42%。左侧供肾组5d动物存活率89.3%(25/28)，右侧供肾组5d动物存活率91.6%(22/24)，采用左右侧供肾对受体存活率、移植物的组织学改变无明显影响。结论：这种方法能节省实验时间，减少供体的数量，符合动物实验的经济和伦理学要求。 【关键词】 肾脏移 显微外科技术 供肾切取 大鼠 大鼠的肾脏移植模型是进行移植免疫研究的重要工具，同时也是进行显微外科训练的经典模型，广泛应用于移植肾的急性、慢性排斥反应，肾性高血压，显微外科技术相关的实验研究。Lee1于1965年首先报道了制作这一模型的具体方法。近几十年来，有多种方法和改进技术应用到该模型，主要目标在于减少并发症，寻找快速稳定的肾脏血管和输尿管的吻合方法2。国内学者也积极进行了大鼠移植模型的优化工作34。多数学者采用供体单侧肾脏进行移植，因右侧肾脏肾静脉较短而被弃用。本研究的目标在于建立从同一供体切取双侧肾脏分别进行大鼠肾脏移植的方法，并对输尿管吻合的方法进行改进。 1 材料与方法 1.1 材料 显微外科手术器械（上海手术器械厂），手术显微镜（xts4，镇江光学仪器厂），110棉纶带线缝合针（上海医用缝合针厂），高渗枸橼酸盐嘌呤溶液（HCA离体肾保存液，上海长征医院)，SPF级雄性封闭群SD大鼠90只（南京军区总医院实验动物中心提供），体质量200300 g。从30个供体切取52只肾脏，分别施行左右侧供肾原位肾脏移植28、24例，肾血管为分支动脉的肾脏不列入实验组。术前不禁食。手术在室温25 、相对湿度60%的清洁非无菌环境中进行。10%盐酸氯胺酮注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司）和硫酸阿托品、酚妥拉明注射液、肝素钠注射液、利多卡因注射液。 1.2 麻醉方法 10%盐酸氯胺酮注射液，15 mg(100 g)-1，肌肉注射麻醉，术中注意保温。 1.3 外科技术 从供体切取双侧肾脏，放入4 肾脏保存液。左侧肾脏植入第1个受体，原位端端缝合肾脏动、静脉，供肾输尿管与受体输尿管上端间断缝合6针。右侧肾脏翻转180后植入第2个受体左侧肾窝，与受体的动脉、静脉、输尿管端端吻合。 1.3.1 供体手术 取十字切口进腹，湿盐水纱布包裹肠管。仔细分离供体右侧和左侧肾脏的动、静脉血管，分别结扎肾上腺动静脉，并使肾脏的动、静脉血管骨骼化，利多卡因注射液滴于表面防止动脉痉挛。游离肾脏和输尿管，输尿管在肾脏下极处离断，保留输尿管周围的脂肪组织。在切取肾脏之前15 min，通过尾静脉注射肝素100 U和甲磺酸酚妥拉明注射液（1mgkg-1）5。在根部结扎左肾动静脉并离断，提起肾动脉外膜，插入4号灌注针进行灌注，灌注液为4 肾脏离体灌注保存液约2 ml（上海长征医院改良HCA）6。同法切取灌注右侧肾脏，在根部离断右肾动脉，带部分腔静脉壁剪取右肾静脉，保留右输尿管约2 cm。两侧肾脏分别放入4 HCA肾脏灌注保存液中备用。切取植入过程如图1示。 1.3.2 受体准备 剑突下正中切口进腹，湿盐水纱布包裹肠管牵向右侧。仔细分离受体左侧肾脏的动、静脉，分别结扎肾上腺动静脉。游离肾脏，在靠近腹主动脉、腔静脉处用显微血管夹阻断左侧肾脏的动、静脉血管，尽量靠近肾门处离断左侧肾脏的动、静脉血管和输尿管。冰肝素盐水冲洗动、静脉管腔。 1.3.3 左侧肾脏原位移植（图2） 左侧供肾置于受体的左侧后腹壁肾窝，冰盐水纱布垫起并覆盖，间断滴注冰盐水保持低温，先吻合动脉，直径一般0.5到0.8 mm，牵开外膜修齐动脉的末端。端端吻合动脉89针，两定点缝合，采用连续缝合间断打结的方法，一般前壁3针后壁3针。静脉的直径11.5 mm，壁薄而娇嫩。180两定点固定，端端连续缝合，开放血流后再收紧打结防止形成狭窄。先开放静脉再开放动脉。输尿管的吻合：吻合口靠近受体输尿管上端，一般需要6针间断缝合，2针对端全层牵引线，前后壁分别2针或1针。通过输尿管的蠕动波、尿液通过吻合口来判断是否漏尿。 1.3.4 右侧肾脏移植（图3） 右侧供肾围绕其长轴旋转180，其凸起的腹侧面靠近左侧肾窝后腹壁。因翻转后原右侧肾静脉靠近背侧，一般先吻合静脉再吻合动脉，方法同左侧供肾。右侧供肾的冷缺血时间120 min。肾静脉、肾动脉、输尿管吻合方法同左侧供肾。 1.3.5 术后处理 缝合移植肾脏上下极的包膜脂肪于腹后壁，以固定移植肾脏，防止血管蒂扭转。分离受体右侧的肾脏血管，结扎切断，同期切除右侧肾脏。温盐水复温，分层缝合关腹，将大鼠置于加热垫上复温，苏醒后喂5%葡萄糖生理盐水，恢复行走后放入鼠笼，正常喂养，定时观察，防止术后尿潴留等，术后存活5 d以上表示模型成功。 1.4 观察指标 记录术中两组的热缺血时间，观察术后受体的存活情况，对死亡的受体进行显微镜尸体检验，记录死亡原因。术后10 d取移植肾，常规固定，HE染色，观察大鼠的移植肾的病理学变化。 2 结 果 从30个供体大鼠切取52只肾脏，分别施行左、右侧供肾原位肾脏移植28、24例。左侧供肾的热缺血时间(27.03.5)min，右侧供肾的热缺血时间(29.03.0)min，两组移植肾的热缺血时间无明显差异。左侧供肾组发生肾动脉血栓、尿瘘、输尿管梗阻各1例，5 d受体存活率为89.3%(25/28)；右侧供肾组发生肾动脉血栓、输尿管梗阻各1例，5 d受体存活率为91.6%(22/24)。受体存活率两组比较差异无统计学意义。左右侧供肾的组织学检查未发现明显肾小管坏死的改变。 3 讨 论 建立移植动物模型是进行器官移植基础研究的必要条件。大动物因价格昂贵、成本高，遗传背景复杂，而不符合选择实验动物标准化的要求。啮齿类动物的器官移植模型在移植生物学的实验研究中占有重要地位7，对器官移植而言，大多数基本原则都是在啮齿类动物模型上建立起来的。大鼠繁殖快，价格便宜，喂养方便，而且大鼠对手术无菌的要求远远低于大动物8。目前已培育出了多种品系，如近交系、突变系、杂交群动物、封闭群动物等，可满足不同层次的研究要求；纯系动物的特性有助于设计最精细的实验，可用最少的动物数而保证得到足够的实验数据。 为了更好、更节省地应用显微外科技术制造大鼠肾脏移植模型，我们建立了从同一供体切取双侧肾脏分别进行大鼠肾脏移植的方法。在Grau等9研究的基础上，从供体切取双侧肾脏分别进行灌注，左侧肾脏植入第1个受体，原位端端缝合肾脏动、静脉，供体输尿管与受体输尿管间断缝合。右侧肾脏翻转180后植入第2个受体左侧肾窝，均采用端端吻合的方法缝合动脉、静脉、输尿管，因肾蒂的解剖关系改变，翻转后右肾静脉靠近腹侧面，一般先吻合静脉再吻合动脉，与左侧肾脏的植入有所不同。在切取供体的双侧肾脏时游离肾脏动静脉血管是关键，尤其是右侧的肾上腺动脉易引起出血，预先显微镜下分离于近端结扎即可控制。离断右侧肾静脉时应尽量靠近下腔静脉，呈弧形剪开，以利吻合。左侧供肾和右侧供肾对植入手术难易程度没有影响，因右侧肾脏静脉带有部分腔静脉壁，进行右侧的供肾静脉和左侧的受体肾静脉端端吻合时较容易进行。 本组进行的肾脏移植血管吻合采用端端吻合的方法，不需要套管、袖套技术辅助，并且不阻断大鼠体循环，符合大鼠生理，受体鼠恢复较快。大鼠的肾动脉吻合方法主要有3种：端端吻合、端侧、袖套式10。袖套式吻合耗时最短11，有利于观察模型的短期效果；如果采用供体肾动静脉与受体腹主动脉下腔静脉端侧吻合12，则需要阻断受体的腹主动脉和下腔静脉，再开放后无氧代谢产物对受体的生理干扰大，影响手术成功率13；端端吻合需要数个月的显微外科训练才能达到熟练掌握，但是这种吻合通畅率高，远期效果最为理想14。近年来有研究发现，在大鼠肾脏动脉吻合口应用由纤维蛋白原和凝血酶组成的生物胶能减少出血，减少缝合针数，降低手术难度，而不影响血管吻合口通畅率1516，本研究的预试验也发现类似结果。我们本实验中对既往输尿管端端吻合的方法17进行改良，采用暂时性内支架辅助的间断缝合，吻合口靠近受体输尿管上端肾盂处。为避免前壁后壁错缝，输尿管内暂时置入70 prolene血管缝线约1 cm作导引指示，有利于显微镜下缝合和打结，降低手术难度。 供肾植入后，只有切除受体的对侧原有肾脏才能更好地观察移植肾的功能。一期同时切除对侧肾脏在移植肾不能即时充分地发挥功能将导致大鼠很快死亡18；再次手术切除受体的对侧原有肾脏则对大鼠造成多次创伤。我们体会，在保证供肾的灌注质量、控制热缺血时间在30 min以内、避免手术出血的情况下并不需要二次手术切除受体的对侧肾脏。 与常规切取一侧肾脏相比较，本方法的优点显而易见，能够减少供体动物的数量约42%（22/52），符合动物伦理学、经济学原则，节省时间19。我们的实验结果显示，左侧供肾和右侧供肾在动物存活率、组织学改变等并无差异。移植肾冷缺血期应保持04 的低温，避免移植物的进一步损伤。研究表明大鼠的冷缺血时间超过1216 h将导致移植肾的不可逆损伤而发生无尿20，受体鼠的死亡率高达100%。我们采用同一手术组先后进行供肾植入术，控制右侧供肾的冷缺血时间在2 h，没有影响到供肾的质量。如果两组受体手术同时进行，则左侧供肾和右侧供肾的冷缺血时间相同。【参考文献】 1LEE S. 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