片微生物限度验证方案.doc

微 生 物 限 度 检 查 法 验 证 += 片微生物限度检查法验证小组二00五年三月+=片微生物限度检查法的验证1. 目的： 确认所采用的方法适合于+=的微生物限度检查，即确认+=在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计。以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。2. 范围： 适用于+=微生物限度检查方法的验证实施。3. 测试环境条件要求：所有检查在环境洁净度10000级下的局部100级洁净度的水平单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境已定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证，并符合要求。4. 内容： 4.1. 所用供试品为我公司综合制剂车间生产的 片重0.36克 规格的+=片，批号为 050301 050302 050303 。 4.2. 初步判断+=片无抑菌性，可直接用常规法进行实验。4.3. 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证过程4.3.1. 菌种及菌液4.3.1.1. 菌种： 大肠埃希菌 CMCC（B） 44 102金黄色葡萄球菌CMCC（B） 26 003枯草芽孢杆菌CMCC（B） 63 501白色念珠菌CMCC（F） 98 001黑曲霉CMCC（F） 98 0034.3.1.2. 对菌种的要求：无菌检查方法验证中所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），本试验所用以上各菌株传代次数分别为：大肠埃希菌，第 3 代；金黄色葡萄球菌，第 3 代； 枯草芽孢杆菌，第 3 代； 白色念珠菌，第 2 代；黑曲霉，第 4 代。4.3.1.3. 菌液的制备：4.3.1.3.1. 取经3035培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄糖球菌 、枯草芽孢杆菌的营养琼脂培养物，用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。4.3.1.3.2. 取经2328培养2448小时的白色念珠菌的改良马丁培养物，用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。4.3.1.3.3. 取经2328培养57天的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，用35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液备用。4.3.2. 培养基的制备：取市售的脱水营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别按照说明书进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中， 然后加塞按经过验证合格的灭菌程序进行灭菌备用。在试验前先加温熔化，然后放于45的恒温水浴锅中保温备用。4.3.3. 稀释液：用pH值7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，按规定配制后，采用经过验证合格的灭菌程序进行灭菌。4.3.4. 实验中所使用的玻璃仪器及金属器皿在使用之前均经过170180干热灭菌至少60分钟。4.3.5. 供试液的制备： 4.3.5.1. 因为供试品的细菌总数及霉菌和酵母菌数的限值分别为10000和100，因此选择10-1和0分别作为细菌总数和真菌数方法验证的稀释级。4.3.5.2. 称取供试品10g，分别加pH值7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml、10ml，加温助溶，温度不超过45，作为10-1、0两个稀释级的供试液。4.3.6. 计数方法验证过程4.3.6.1. 试验组4.3.6.1.1. 2个平皿做大肠埃希菌：每个平皿加110的供试品稀释液1ml和大肠菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的营养琼脂培养基1520ml，倒置，3035培养48小时。4.3.6.1.2. 2个平皿做金黄色葡萄球菌：每个平皿加110的供试品稀释液1ml和金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的营养琼脂培养基1520ml，倒置，3035培养48小时。4.3.6.1.3. 2个平皿做枯草芽孢杆菌：每个平皿加110的供试品稀释液1ml和枯草芽孢杆菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的营养琼脂培养基1520ml，倒置，3035培养48小时。4.3.6.1.4. 2个平皿做白色念珠菌：每个平皿加0稀释级的供试品稀释液1ml和白色念珠菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的玫瑰红钠琼脂培养基1520ml，倒置，2328培养72小时。4.3.6.1.5. 2个平皿做黑曲霉：每个平皿加0稀释级的供试品稀释液1ml和黑曲霉孢子悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的玫瑰红钠琼脂培养基1520ml，倒置，2328培养72小时。4.3.6.2. 菌液组：4.3.6.2.1. 2个平皿做大肠埃希菌：每个平皿加大肠菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的营养琼脂培养基1520ml，倒置，3035培养48小时。4.3.6.2.2. 2个平皿做金黄色葡萄球菌：每个平皿加金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的营养琼脂培养基1520ml，倒置，3035培养48小时。4.3.6.2.3. 2个平皿做枯草芽孢杆菌： 每个平皿加枯草芽孢杆菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的营养琼脂培养基1520ml，倒置，3035培养48小时。4.3.6.2.4. 2个平皿做白色念珠菌：每个平皿加白色念珠菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的玫瑰红钠琼脂培养基1520ml，倒置，2328培养72小时。4.3.6.2.5. 2个平皿做黑曲霉：每个平皿加黑曲霉孢子悬液1ml，然后倾注温度不超过45溶化的玫瑰红钠琼脂培养基1520ml，倒置，2328培养72小时。4.3.6.3. 供试品对照组：取四个平皿，其中两个加入110稀释级供试液各1ml，另两个加入0稀释级供试液各1ml，分别倾注不超过45的营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，倒置，分别按规定培养。4.3.6.4. 常规法无稀释液对照组。4.3.7. 试验结果：4.3.7.1. 第一次试验结果菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验组195112926059291106945655平均93114935857菌液组1366040555123058385951平均3359395751供试品对照组细菌167263平均65霉菌、酵母菌114216平均15回收率85%83%72%75%82% 检验者： 复核者： 年 月 日4.3.7.2. 第二次试验结果菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验组19710414430222911121502420平均941081472721菌液组13557841432375388105平均365586124供试品对照组细菌169267平均68霉菌、酵母菌118218平均18回收率72%73%92%75%75%检验者： 复核者： 年 月 日4.3.7.3. 第三次实验结果：菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验组188911047477284951107071平均86931077274菌液组1273849505622534555454平均2636525255供试品对照组细菌167263平均65霉菌、酵母菌131227平均29回收率81%78%81%83%82% 检验者： 复核者： 年 月 日 试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数注：试验组的菌回收率= 100% 菌液组的平均菌落数4.3.8. 结论： 通过以上三次平行试验，可以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。 方案实施人： 年 月 日4.4. 控制菌检查方法的验证4.4.1. 验证的目的：一是检验方法的灵敏性、检出率（能否检出，方法的可行性），二是检验方法的专属性，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。4.4.2. 验证菌株4.4.2.1. 本品的控制菌检查要求为每1g中不得检出大肠埃希菌，每10g中不得检出沙门菌。因此选择大肠埃希菌和乙型付伤寒沙门菌为验证菌株。4.4.2.2. 菌液的制备：分别接种大肠埃希菌和乙型付伤寒沙门菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，3035培养1824小时，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。4.4.3. 阴性对照菌液的制备：按照“微生物限度检查法”的规定，验证大肠埃希菌和沙门菌都要选择金黄色葡萄糖球菌作为阴性对照菌，因此接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，3035培养1824小时，然后用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液备用。4.4.4. 培养基的制备：4.4.4.1. 取市售的脱水胆盐乳糖培养基，按说明书配制，分装于三角烧瓶中，每瓶100ml，加塞，采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。4.4.4.2. 取市售的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基，按说明书配制，分装于试管中，每管5ml，加塞， 通过验证合格的灭菌程序进行灭菌。4.4.4.3. 营养肉汤培养基，按说明书配制，分装于三角烧瓶中，每瓶100ml，加塞，采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。4.4.5. 供试液的制备及其他用具的准备：同细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证。4.4.6. 操作过程4.4.6.1. 试验组：取1：10供试品稀释液10ml（相当于1g）和大肠菌悬液1ml（10100cfu）接种至100ml胆盐乳糖培养基中，3537培养 24小时（必要时可延长至48小时）。取0稀释级供试品液10ml（相当于10g）和乙型付伤寒沙门菌悬液1ml（10100cfu）接种至200ml营养肉汤培养基中，混匀，3537培养 24小时。4.4.6.2. 阴性对照组：取1：10供试品稀释液10ml（相当于1g）和金黄色葡萄球菌悬液1ml（10100cfu）接种至100ml胆盐乳糖培养基中，3537培养 24小时（必要时可延长至48小时）。取0稀释级供试品液10ml（相当于10g）和金黄色葡萄球菌悬液1ml（10100cfu）接种至200ml营养肉汤培养基中，混匀，3537培养 24小时。4.4.7. 结果： 试验组： 检出试验菌 阴性对照组： 未检出阴性对照菌 4.4.8. 结论： 通过以上试验，可以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。 方案实施人： 年 月 日验证报告验证项目名称验证起止日期开始： 年 月 日，结束： 年 月 日验证工作负责验证部门人员参加